范莎莎等

摘 要 為了早期發(fā)現(xiàn)并監(jiān)測(cè)肝癌，通過ELISA法檢測(cè)肝癌組與正常組血清IL17細(xì)胞因子水平，運(yùn)用ROC統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較其與AFP診斷肝癌的診斷效能，logistic回歸獲得IL17和AFP兩者聯(lián)合診斷的模型預(yù)測(cè)肝癌.結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組的IL17質(zhì)量濃度（5.76±2.35 ng/L）較對(duì)照組（2.98±2.53 ng/L）明顯增高（P*<0.001），ROC分析IL17和AFP預(yù)測(cè)肝癌的曲線下面積（AUC）分別為0.820和0.884，兩者對(duì)診斷均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.通過Logistic 逐步回歸得出的AFP和IL17回歸模型PRE，預(yù)測(cè)肝癌的ROC曲線下面積為0.963，診斷的敏感度（87.5%）、特異度（82.1%）較兩指標(biāo)單獨(dú)診斷時(shí)明顯提高.因此本研究獲得的診斷模型可以用于臨床對(duì)肝癌的聯(lián)合診斷.

關(guān)鍵詞 肝癌；IL17；logistic 回歸；受試者診斷特征曲線；甲胎蛋白

中圖分類號(hào) R7357文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 10002537（2014）03001905

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma， HCC）是最常見的肝原發(fā)惡性腫瘤， 因?yàn)榘l(fā)病率較高、發(fā)現(xiàn)困難、治療方法少等原因，在導(dǎo)致人類死亡的各種疾病中位居前列[1].目前，原發(fā)性肝細(xì)胞癌在全球范圍內(nèi)致死率位列第五位，而在一些非洲和亞洲國(guó)家，原發(fā)性肝細(xì)胞癌在腫瘤性死因中已經(jīng)位居首位[23].肝癌早期轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是肝癌患者生存率低的主要原因.目前有效的肝癌診斷標(biāo)志物寥寥無幾，當(dāng)前的檢測(cè)技術(shù)仍然不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和有效檢測(cè)早期階段的肝癌[45].

超聲和AFP檢測(cè)是最常用的篩查肝癌方法，然而超聲檢測(cè)依賴于醫(yī)師的專業(yè)知識(shí)和設(shè)備實(shí)際靈敏度，難以對(duì)腫塊的良惡性予以評(píng)估和診斷.AFP被認(rèn)為是用于篩查和早期診斷肝癌最實(shí)用且可行的方法，40%～60%HCC患者的AFP值增高，然而還有很大一部分肝癌患者其AFP值沒有增高[67]，因此AFP用作唯一的工具來診斷肝癌仍然存在較大的漏診率[89].

IL17具有促腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的作用.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明IL17具有促進(jìn)多種腫瘤生長(zhǎng)的作用，這些腫瘤包括纖維肉瘤、結(jié)腸癌、皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌等[1012].研究認(rèn)為IL17能通過聚集血管內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)腫瘤血管的形成，也能促進(jìn)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、前列腺素、趨化因子、巨噬細(xì)胞炎性蛋白2，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的粘附和運(yùn)動(dòng)，為腫瘤血管的形成和癌細(xì)胞播散提供條件[1213].

基于以上IL17與腫瘤和肝癌的各種相關(guān)報(bào)道，結(jié)合已有的AFP的臨床價(jià)值，檢測(cè)IL17在肝癌血清中的表達(dá)情況及評(píng)估與AFP的相關(guān)性顯得非常有意義，這樣更有利于系統(tǒng)地分析和檢驗(yàn)二者的檢驗(yàn)效能，以便更好地對(duì)其進(jìn)行利用.

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

篩選2013年9月和2013年12月在湖南省人民醫(yī)院就診的肝癌病人和健康體檢者，其中肝癌患者入組條件為：未經(jīng)過任何治療，經(jīng)病理或者臨床診斷為肝癌的患者.共有84名受試者參與，并分為以下兩組：健康對(duì)照組，包括32名，年齡范圍為21～72歲（平均年齡43±15歲）；肝癌組共52名，男45例，女7例，年齡范圍為27～80歲（平均年齡54±12歲），各組人員在入院后進(jìn)行相應(yīng)治療之前，完成CT、超聲、血生化常規(guī)、血清AFP檢測(cè)，各組實(shí)驗(yàn)對(duì)象資料見表1.

1.2 標(biāo)本收集

用真空采血針取患者晨起空腹3 mL靜脈全血，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，提取離心后的血清.血清保存在-80 ℃，保存至同批測(cè)定.

1.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzymelinked Immunosorbent Assay）檢測(cè)人血清IL17質(zhì)量濃度.使用人IL17酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（ CSBE14917H， Cusabio Biotech），檢測(cè)濃度下限（LLD）為7.8 ng/L.批內(nèi)精密度（化驗(yàn)內(nèi)精度）CV%<8%，批間精密度（檢測(cè)精度之間）CV%<10%.Biotech 酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本孔吸光值.Curve Expert 1.4軟件計(jì)算和繪制ELISIA標(biāo)準(zhǔn)品曲線，并計(jì)算各孔的質(zhì)量濃度.

1.4 應(yīng)用Roche電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清AFP質(zhì)量濃度

按試劑盒說明書處理樣本后，吸取10 μL標(biāo)本與生物素化抗AFP單克隆抗體和釘標(biāo)記的抗AFP抗體混勻，加入鏈霉親合素包被的微粒，反應(yīng)混合液吸到測(cè)量池中，微粒通過磁鐵吸附到電極上，電極加電壓后產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過光電倍增管進(jìn)行測(cè)定.檢測(cè)結(jié)果由Elecsys軟件自動(dòng)測(cè)出.

1.5 軟件分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.應(yīng)用受試者診斷特征曲線（receiver operator characteristic curve ROC）評(píng)估指標(biāo)的預(yù)測(cè)效能，得到曲線下面積（Area Under the Curve， AUC）.最大約登指數(shù)計(jì)算臨界值（Cutoff points），約登指數(shù)（Youden index）=敏感度+特異度-1.各組均值比較，兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).logistic逐步回歸分析.所有結(jié)果以雙尾檢驗(yàn)P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.Medcalc軟件繪制ROC曲線.

2 結(jié)果

2.1 正常組與肝癌組血清IL17的質(zhì)量濃度

圖1 正常組與肝癌組血清IL17質(zhì)量濃度

Fig.1 Serum levels of IL17 in HCC group and control group

結(jié)果顯示IL17在肝癌組中質(zhì)量濃度明顯高于正常組，分別為5.76±2.35 ng/L和2.98±2.53 ng/L（P*<0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).見圖1.

2.2 血清IL17診斷肝癌組與正常組的效能分析

以IL17的血清質(zhì)量濃度為變量做ROC曲線，檢測(cè)其作為肝癌血清診斷標(biāo)志物的可能性，結(jié)果顯示IL17和AFP分別單獨(dú)作為標(biāo)志物對(duì)肝癌與正常組進(jìn)行區(qū)分時(shí)，其曲線下面積AUC分別為0820 （P<0.001）和0.884 （P<0.001），見圖2和表2，二者作為血清標(biāo)志物均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.IL17診斷的特異度較AFP低，但敏感性較AFP增加.選擇截?cái)帱c(diǎn)IL17為2.455 ng/L時(shí)，敏感度為67.3%，特異度為87.5%.當(dāng)AFP為32.4 μg/L截?cái)帱c(diǎn)時(shí)約登指數(shù)最大，其敏感度為61.5%，特異度為100%，如表3.若選擇以20 μg/L的診斷指標(biāo)為截?cái)帱c(diǎn)，其敏感度為61.5%，特異度為90.6%.

3 討論

原發(fā)性肝癌的早期診斷對(duì)提高患者的5年生存率以及生存質(zhì)量十分重要.在中國(guó)，AFP目前仍然被作為篩查和早期診斷肝癌的主要指標(biāo)，主要由于其應(yīng)用的方便和指標(biāo)具備一定的特異性，肝癌患者約60%血清中的AFP較正常人增高[14]，但是AFP的敏感度和特異度對(duì)于臨床診斷來說還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，即使聯(lián)合已有的指標(biāo)DCP或AFPL3時(shí)，診斷肝癌患者的敏感度也僅為78.3%[1415].因此，尋找更加敏感和特異的肝癌診斷指標(biāo)有著非常重要的臨床意義，也是目前肝癌研究的重點(diǎn)方向.

本研究應(yīng)用了受試者診斷特征曲線分析，判斷指標(biāo)的潛在診斷價(jià)值.在AUC>0.5的情況下，AUC越接近于1，說明診斷效果越好.通過ROC分析，結(jié)果顯示肝癌患者IL17血清質(zhì)量濃度為2.455 ng/L臨界點(diǎn)時(shí)，其曲線下面積（AUC=0.820）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.目前關(guān)于IL17與肝癌轉(zhuǎn)移的報(bào)道在國(guó)內(nèi)外還非常少，僅有IL17增高與肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)的類似研究，當(dāng)IL17大于0.9 ng/L時(shí)，肝癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)概率增高，遠(yuǎn)期生存質(zhì)量較差，預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的敏感度為63.3%，特異度為91.1%[16].另外也有報(bào)道178例肝癌患者，腫瘤內(nèi)IL17質(zhì)量濃度與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)及生存相關(guān)，是預(yù)后的不良因素，認(rèn)為IL17質(zhì)量濃度與腫瘤的微血管密度正相關(guān)，可能的機(jī)制為IL17能夠促進(jìn)血管生成，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[17].

Logistic回歸分析是一類數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，可以從大量的醫(yī)學(xué)信息和臨床數(shù)據(jù)中提取有用的信息和知識(shí)，建立某種疾病的診斷或治療模型.臨床醫(yī)生進(jìn)行診斷時(shí)如果利用計(jì)算機(jī)輔助診斷的logistic回歸模型，其準(zhǔn)確率可得到提高.本研究構(gòu)建的IL17和AFP的logistic回歸模型其診斷肝癌的效能較IL17和AFP均增高，該模型在國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)中還未見報(bào)道.

本研究發(fā)現(xiàn)在肝癌血清中IL17質(zhì)量濃度較正常組增高，因此IL17可作為診斷肝癌的標(biāo)志物，其敏感度較AFP高.同時(shí)獲得了IL17和AFP兩指標(biāo)聯(lián)合診斷的logistic回歸模型，其ROC的曲線下面積AUC（0964）較兩指標(biāo)單獨(dú)診斷的曲線下面積均高，且敏感度和特異度都提高.本研究還有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，驗(yàn)證其logistic回歸診斷模型的診斷效能.

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（編輯 王 ?。?