陳 昊 ，李曉寧，薛 菲，王 岸，周 超

（上海市周浦醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 201318）

急性肺損傷（ALI）／急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）死亡率達(dá) 32%～50%［1］。膿毒癥是 ALI／ARDS的重要病因，膿毒癥時基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）激活可能是肺損傷的重要因素［2～4］。目前國內(nèi)對膿毒性肺損傷MMP－9的研究未見報道。本試驗通過盲腸結(jié)扎穿刺研究大鼠膿毒性急性肺損傷MMP－9的血清表達(dá)以及肺損傷病理相關(guān)性，探討MMP－9在ALI形成及預(yù)后判斷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠50只，體重230～250g，購自第二軍大醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 50只SD大鼠完全隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM組）8只和CLP手術(shù)組42只（6、12、24、48h）。6、12h組各8只，24h組10只和48h組16只。CLP組分別在設(shè)定時間處死仍存活的大鼠；SHAM組在48小時后處死作為對照組。

1.2.2 建立CLP致急性膿毒癥性肺損傷動物模型

1.2.2.1 手術(shù)組（CLP組） 適應(yīng)性飼養(yǎng)實驗動物1周，在手術(shù)前禁食12h。戊巴比妥納按40mg／kg劑量、腹腔注射麻醉后，將仰臥位大鼠固定在手術(shù)板，在中腹手術(shù)區(qū)去毛和消毒后，用手術(shù)刀經(jīng)腹壁行一約2cm切口，進(jìn)腹后在以3號絲線在回盲瓣末端分離并結(jié)扎盲腸，用50ml針筒針頭在結(jié)扎末端穿刺3次，并擠出少許糞便，然后用4號絲線依次逐層縫合腹膜至皮膚。手術(shù)完成后皮下注射NS 100ml／kg抗休克。手術(shù)組在6、12、24和48h處死實驗大鼠，并留取實驗標(biāo)本。

1.2.2.2 假手術(shù)組（SHAM 組） 在開腹后僅翻動腸道后關(guān)腹，不予手術(shù)結(jié)扎穿刺及皮下注射NS補(bǔ)液。

1.3 評價指標(biāo)測定

1.3.1 生存率 記錄各實驗組大鼠的實際生存率。

1.3.2 標(biāo)本采集

1.3.2.1 血清標(biāo)本采集 在預(yù)定時間點(diǎn)處死實驗動物取血置于抗凝管管中，使用低溫離心機(jī)（2000r／min）離心30分鐘，取血清后立即凍存在－80℃冰箱中，留待炎癥因子測定。

1.3.2.2 肺組織標(biāo)本 預(yù)定時間點(diǎn)處死實驗組動物后，在無菌條件下開胸取肺，迅速用吸水紙吸取左肺表面水分以及血液，使用電子天平稱重，迅速置于90℃烤箱烘干72小時后，再次稱取干重，并計算肺組織的干／濕重比（W／D）。右肺下葉用10%甲醛固定，留待病理學(xué)檢查評分。

1.3.3 炎癥因子測定 MMP－9、IL－8、IL－10、IL－1測定，采用雙抗體夾心E L I S A法檢測，試劑盒均購自上海西塘公司。

1.3.4 病理檢查 取開胸后留存右肺下葉用10%福爾馬林固定后石蠟包埋切片，HE染色，觀察肺組織病理。參照Smith評分法［5］的方法并進(jìn)行病理評分。

2 結(jié)果

2.1 生存率 CLP手術(shù)后48小時組大鼠的生存率為31.2%，24小時生存率為60%，12和6小時均無死亡。假手術(shù)組無死亡。

2.2 W／D比 對照組W／D水平在CLP手術(shù)后6和12小時出現(xiàn)下降（P＜0.01），6和12小時組間無明顯差異（P＞0.05）。24小時組 W／D水平仍下降，同12小時組相比，差異有顯著性（P＜0.01）。48小時組W／D水平出現(xiàn)上升，同24小時組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.005），見表1。

表1 肺干濕重比（W／D）比較（）Table 1 W／D of the lung

表1 肺干濕重比（W／D）比較（）Table 1 W／D of the lung

肺病理評分SHAN組 4.62±0.56①分組 W／D 0.67±0.5166h 4.63±0.11① 0.60±0.54812h 4.37±0.13 1.25±0.50024h 4.47±0.09 2.67±0.51648h 4.86±0.04 3.60±0.548

2.3 在本實驗中，MMP－9、IL－8、IL－1、IL－10血清水平變化及統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表2 盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)后各組血清水平變化情況（）Table 2 MMP－9，IL－8，IL－6and IL－10after CLP

表2 盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)后各組血清水平變化情況（）Table 2 MMP－9，IL－8，IL－6and IL－10after CLP

分組 IL－1（pg／ml） IL－8（pg／ml） IL－10（pg／ml） MMP9（pg／ml）SHAH 組 8.59±7.21 150.15±43.99 13.08±7.61 12.15±5.666h 43.46±25.33 1394.92±109.98 22.52±8.35 9.50±1.8112h 58.84±35.48 1665.12±256.45① 53.09±57.83① 12.47±2.5024h 59.47±37.06 2201.55±147.39② 61.00±20.61② 31.80±3.62②48h 141.33±68.58② 3582.41±2304.93② 60.99±40.09② 45.27±21.38②

2.3.1 CLP手術(shù)組大鼠12、24hMMP－9與對照組相比明顯上升（P＜0.01），48小進(jìn)一步升高（P＜0.01），見圖1－1。

2.3.2 CLP手術(shù)組大鼠IL－8各個時間點(diǎn)有持續(xù)升高趨勢，12小時組較對照組升高（P＜0.05），24及48小時組較對照組顯著升高（P＜0.01），見圖1－2。

2.3.3 CLP手術(shù)組大鼠0～24小時IL－1有持續(xù)升高趨勢，48小時組較對照組顯著升高（P＜0.01），見圖1－3。

2.3.4 CLP手術(shù)組大鼠，12、24、48hIL－10同對照組相比均升高（P＜0.05），而12、24及48h組未有進(jìn)一步升高趨勢，見圖1－4。

圖1 水平示意Figure 1 MMDP，IL－8，IL－1and IL－10

2.4 病理情況 對照組及假手術(shù)組光鏡下觀察，對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，未有明顯炎癥以及水腫變化。CLP手術(shù)后隨造模時間延長肺損傷進(jìn)行性加重。6小時組未見明顯的肺組織變化；12小時組可見輕微的肺間質(zhì)增寬，未有明顯水腫、滲出及少量炎性細(xì)胞浸潤；24小時組出現(xiàn)肺泡間隔增寬，肺泡腔塌陷，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，紅細(xì)胞滲出，并有支氣管內(nèi)出血，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，見圖2、3。48小時組肺泡間隔增寬進(jìn)一步加重，大量肺泡組織結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)局灶性肺不張和肺氣腫，肺泡間結(jié)締組織出現(xiàn)明顯增生，僅少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間出現(xiàn)少量液體滲出，見圖4。病理評分前12小時無明顯變化（P＞0.05），12、24和48h出現(xiàn)增高（均P＜0.01），病理組織評分見表2。

圖2 CLP后24小時肺組織病理 炎癥細(xì)胞浸潤（HE染色，×100）Figure 2 Inflammatory cell infiltration 24 hour after CLP

圖3 CLP后24小時肺組織病理 肺出血（HE染色，×100）Figure 3 Pulmonary hemorrhage 24hour after CLP

圖4 CLP后48小時肺組織病理（HE染色，×100）Figure 4 Pulmonary pathology 48hafter CLP

2.5 相關(guān)性研究 分別對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，均為正態(tài)分布。然后行Pearson相關(guān)性分析，再行相關(guān)系數(shù)的假設(shè)檢驗。MMP9等炎癥因子同肺損傷病理評分相關(guān)系數(shù)（MMP9、IL1、IL8均P＜0.01，IL－10 P＜0.05）MMP9的相關(guān)性最高（r＝0.704，P＜0.01），見表3。

表3 MMP－9等炎癥因子同肺損傷病理相關(guān)性分析Table 3 The relation of inflammatory factors and pathology of pulmonary injury

3 討論

3.1 膿毒癥性肺損傷動物模型的建立 ALI／ARDS臨床特征是難以糾正的低氧血癥。細(xì)胞因子在膿毒癥性肺損傷中其關(guān)鍵性作用。既往動物實驗研究以使用直接建立肺損傷的模型方法較多，包括注射油酸、鹽酸吸入等直接建立肺損傷模型的方法。直接肺損傷因素誘發(fā)肺損傷出現(xiàn)的時間以及病理過程同膿毒性肺損傷的特征有明顯區(qū)別，本實驗主要的研究內(nèi)容是膿毒癥后的肺損傷，故不考慮使用。而目前膿毒癥模型有內(nèi)因性中毒模型和細(xì)菌感染模型兩種。前者以LPS腹腔注射為主，后者一般使用盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）手術(shù)的方法。在研究膿毒癥繼發(fā)肺損傷的動物模型選擇上使用CLP更接近于臨床實際［6］。

本實驗24小時大鼠生存率60%，48小時生存率31.2%，同國外的實驗?zāi)Ｐ脱芯康慕Y(jié)果基本相同［7］。IL－1、IL－8、IL－10等肺損傷相關(guān)炎癥因子明顯升高。更重要的是肺組織病理評分隨時間增加。24小時組及48小時組出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)肺泡腔塌陷，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，氣管內(nèi)出血，局灶性肺不張和肺氣腫等肺損傷變化。根據(jù)肺病理我們考慮大鼠膿毒癥后明顯肺損傷出現(xiàn)于24小時，并在48小時出現(xiàn)肺損傷。膿毒癥后肺損傷的模型可以通過該方法建立。

3.2 細(xì)胞因子變化 目前文獻(xiàn)報道與肺損傷有明確關(guān)系的炎癥因子主要包括白介素（IL－1、IL－8、IL－10）［8～10］。而本研究中同樣發(fā)現(xiàn)以上炎癥因子均出現(xiàn)明顯升高。各種炎癥因子高峰在24～48h出現(xiàn)，表明IL－1等均參與了肺損傷的病理過程。相關(guān)性分析表明，IL－10與肺損傷顯著相關(guān)。本實驗中IL－10在12小時已出現(xiàn)高峰，肺損傷出現(xiàn)后IL－10水平無明顯變化。IL－10對免疫應(yīng)答起抑制作用，有實驗表明急性肺損傷患者肺組織中IL－10水平降低提示可能發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征。IL－10具有明顯的對抗淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺組織中浸潤作用，從而減輕肺損傷［11］。本實驗中存活大鼠的IL－10水平持續(xù)不下降，也說明IL－10可能抑制膿毒性肺損傷。

IL－1、IL－8與肺病理評分的結(jié)果有較高的相關(guān)性。IL－1、IL－8和 MMP－9均在24小時后出現(xiàn)進(jìn)一步升高。炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)早期聚集的趨化因子是IL－1，IL－1合成后一部分進(jìn)入血流，吸引激活各種炎癥細(xì)胞并能誘導(dǎo)IL－8產(chǎn)生；IL－8對炎癥細(xì)胞有強(qiáng)力的趨化作用。IL－8同其他炎癥因子的區(qū)別在于持續(xù)升高，48小時仍有明顯繼續(xù)升高。在CLP后48小時肺損傷的病理已經(jīng)轉(zhuǎn)為慢性的炎癥變化，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，增生開始增多。而IL－1和IL－8膿毒癥中主要作用為趨化炎癥細(xì)胞浸潤，這說明膿毒性肺損傷后期MMP－9可能起到更重要的作用［12］。我們認(rèn)為膿毒癥后期IL－1和IL－8水平增高能誘導(dǎo)MMP－9的表達(dá)，并造成肺損傷的進(jìn)展。

3.3 MMP－9表達(dá)的變化 我們發(fā)現(xiàn)，MMP－9與肺病理損傷相關(guān)性最高。MMP－9與肺損傷的相關(guān)系數(shù)高于IL－1、IL－8、IL－10。MMP－9在 CLP手術(shù)24小時后才出現(xiàn)明顯上升，與IL－1、IL－8和IL－10的表現(xiàn)有明顯區(qū)別。CLP后24小時MMP－9與肺損傷同步出現(xiàn)，并在大鼠出現(xiàn)肺損傷的48小時有進(jìn)一步升高。

在膿毒癥發(fā)生后，MMP－9活性的升高能夠大量降解肺泡上皮細(xì)胞外基質(zhì)，并導(dǎo)致肺泡滲出液大量產(chǎn)生，炎癥介質(zhì)的進(jìn)一步釋放，引起急性肺損傷的發(fā)生。有動物實驗研究表明，MMPS在急性肺損傷中水平升高，肺泡內(nèi)的免疫復(fù)合物誘導(dǎo)了肺損傷；MMP－9還影響對于炎癥細(xì)胞通過細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜以及內(nèi)皮細(xì)胞層來控制氣道的炎癥［13，14］。另有研究表明，MMP－9同時可以裂解各種細(xì)胞因子和促炎因子，轉(zhuǎn)化為更為強(qiáng)力的炎癥因子，MMP－9在免疫反應(yīng)中起著調(diào)節(jié)和放大的作用［15］。在本實驗中 MMP－9的增高同肺病理損傷的發(fā)展是同步的。

MMP－9在膿毒癥發(fā)生后能降解內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)，同時還可以破壞細(xì)胞基底膜、內(nèi)皮細(xì)胞層和細(xì)胞外基質(zhì)，刺激肺泡液滲出同時釋放大量的炎癥介質(zhì)。另外MMP－9還可以增強(qiáng)炎癥因子效應(yīng)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移并在肺組織浸潤，刺激肺成纖維細(xì)胞，以及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的實質(zhì)細(xì)胞，再次釋放出 MMPs，從而放大了肺組織的損傷。MMP－9可能在膿毒癥繼發(fā)的肺損傷中起到了關(guān)鍵性的作用。

既往文獻(xiàn)報道，肺損傷發(fā)生后W／D水平上升，本實驗結(jié)果同實驗預(yù)計不相符。我們考慮在重度CLP后，大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重膿毒癥出現(xiàn)血管擴(kuò)張和血液分布異常，血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性破壞以及微血栓形成均可以引起血漿外滲有效循環(huán)血量不足。同時膿毒癥后大鼠處于高代謝狀態(tài)，體液消耗增快。而重度CLP大鼠我們觀察到在術(shù)后早期是停止進(jìn)食飲水，雖然已經(jīng)進(jìn)行皮下的常規(guī)補(bǔ)液，但結(jié)合術(shù)后24小時大鼠平均15g以及術(shù)后48小時35g的體重下降。在重度CLP下，常規(guī)補(bǔ)液量可能是不充足的。大鼠在無有效補(bǔ)充液體情況下出現(xiàn)嚴(yán)重休克，由于嚴(yán)重的休克出現(xiàn)未出現(xiàn)明顯肺水增加，W／D在前24小時出現(xiàn)下降，而在24小時后大鼠開始飲水休克得到一定代償，在24～48小時出現(xiàn)W／D升高。

4 結(jié)論

CLP手術(shù)后大鼠24小時出現(xiàn)明顯肺損傷，48小時生存大鼠均可以出現(xiàn)嚴(yán)重肺損傷。MMP－9同肺損傷的相關(guān)性比IL－1、IL－8、IL－10更明顯。MMP－9的水平上升可能提示肺損傷的發(fā)生。MMP－9可能在膿毒癥后肺損傷的形成過程中扮演著關(guān)鍵性角色。

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