黃海東，康景佳，尹 祿，管 迪，張 欣，李泓甫

（武警遼寧省總隊醫(yī)院眼科，遼寧 沈陽 110034）

角膜基質(zhì)細(xì)胞（corneal stromal fibroblasts）作為角膜基質(zhì)的重要細(xì)胞成分之一，是角膜維持透明性的關(guān)鍵因素，在角膜基質(zhì)代謝中起重要作用。角膜發(fā)生潰瘍時，角膜基質(zhì)細(xì)胞活化，變形，進(jìn)而纖維化，成為角膜成纖維細(xì)胞的主要來源，參與組成角膜防御系統(tǒng)［1，2］。cyclinD1是細(xì)胞增生內(nèi)源性調(diào)控系統(tǒng)的主要組成部分，在G1期啟動，調(diào)控G1～S期過程，是細(xì)胞增生調(diào)控的主要增生信號［3，4］。本研究觀察反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染對人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生的影響效果，旨在為眼科疾病的基因治療提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)所用的人角膜組織均在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院眼庫獲得。將人角膜組織裁剪成塊后進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)以獲得人角膜基質(zhì)細(xì)胞。通過胰蛋白酶消化法按照1∶2傳代獲得處于生長期的第2代人角膜基質(zhì)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 美國Gibco公司生產(chǎn)的陽離子脂質(zhì)體lipofectamine；北京大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室存有的反義cyclinD1基因；美國Maxim公司研發(fā)的鼠抗人／兔cyclinD1單克隆抗體工作液以及兔抗鼠SP免疫組織化學(xué)試劑盒；美國Sigma公司生產(chǎn)的MTT（四甲基偶氮唑鹽）；北京昌化精細(xì)化工廠制造的DMSO（二甲基亞砜）；美國NAPCO公司生產(chǎn)的CO2恒溫培養(yǎng)箱；日本Olympus公司制造的生物顯微鏡；香港悅泰洋行銷售的酶聯(lián)免疫檢測儀。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞計板制備角膜基質(zhì)單細(xì)胞懸液共2×105／mL，取2ml在3個內(nèi)置蓋玻片的6孔板內(nèi)進(jìn)行接種，3個板分別對應(yīng)3組。以無血清DMEM液對1μl的反義cyclinD1質(zhì)?；?μl的 PBS至100μl，稀釋 4μl的 Lipofectamine 或 4μl的 PBS 至100μl，輕混稀釋液，室溫下進(jìn)行孵育（30min），加入無血清培養(yǎng)液0.8ml，緩慢加入轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備細(xì)胞中（細(xì)胞80%融合，無血清DMEM沖洗），放置在CO2恒溫培養(yǎng)箱（37度）24小時，除掉轉(zhuǎn)染液，加入DMEM培養(yǎng)液（含20% 的FBS）進(jìn)行培養(yǎng)，每日換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。終止轉(zhuǎn)染后第2、6、10d，在3個板中取細(xì)胞爬片，冷丙酮固定后PBS沖洗，加入鼠抗人／兔cyclinD1單克隆抗體（比例為1∶100），4℃下放置1夜，加入經(jīng)過生物素標(biāo)記處理的兔抗鼠二抗（1∶200），返藍(lán)，脫水，透明，封片及攝片處理后，生物顯微鏡下進(jìn)行觀察cyclinD1蛋白表達(dá)。

1.3 評價指標(biāo) 免疫細(xì)胞化學(xué)法記錄轉(zhuǎn)染后cyclinD1蛋白表達(dá)情況。0.5%錐蟲藍(lán)染色法分析細(xì)胞活性。生物顯微鏡下細(xì)胞核顯示為棕褐色著染陽性。用Combridge Quantimete 970型圖像分析儀以及Quips軟件編制測量cyclinD1陽性信號程序。生物顯微鏡攝取細(xì)胞圖像，中央處理器進(jìn)行細(xì)胞樣本掃描、轉(zhuǎn)換及測量細(xì)胞陽性信號吸光度值（A值）。MTT法檢測測定570nm下每孔吸光度值（A570值）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計數(shù)資料用表示，各組樣本均數(shù)采用方差齊性檢驗(yàn)，不同時點(diǎn)的A值及A570值用單因素方差分析，組間比較采用LSD－t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染后cyclinD1蛋白表達(dá)情況 對照1組和對照2組提示多數(shù)細(xì)胞核cyclinD1染色呈陽性，實(shí)驗(yàn)組僅有少量細(xì)胞核cyclinD1染色呈陽性，見圖1、2。轉(zhuǎn)染后，對照1組與對照2組A值略有下降，但兩組間無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組A值下降明顯，與對照1、2組比較，差異有顯著性，見表1。

圖1 對照1組轉(zhuǎn)染后，大量細(xì)胞核cyclinD1量細(xì)胞核cyclinD1染色呈陽性Figure 1 Large amount of positive dyeing of cyclinD1in nucleus in control group 1

圖2 反義cyclinD1轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后，少 染色呈陽性Figure 2 Few positive dyeing of cyclinD1in nucleus after antisense cyclinD1transfection

表1 不同時間點(diǎn)各組轉(zhuǎn)染后cyclinD1表達(dá)情況（）Table 1 The comparison on cyclinD1expression after gene transfection for different time

表1 不同時間點(diǎn)各組轉(zhuǎn)染后cyclinD1表達(dá)情況（）Table 1 The comparison on cyclinD1expression after gene transfection for different time

組別2d 6d 10d對照1組658.29±29.37645.97±36.18662.87±31.65對照2組 678.34±42.41650.83±60.42625.76±54.64實(shí)驗(yàn)組 426.32±56.39438.36±63.25454.27±71.18 F 15.397 12.937 9.254 P 0.023 0.021 0.037

2.2 反義cyclinD1轉(zhuǎn)染后人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生的改變 反義cyclinD1轉(zhuǎn)染后，A570值顯著低于未進(jìn)行反義cyclinD1轉(zhuǎn)染的對照1組和對照2組，差異有顯著性（P＜0.05），提示反義cyclinD1具有抑制人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生的作用。對照1組與對照2組間A570值無顯著性差異（P＞0.05），提示lipofectamine對人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生無顯著作用，見表2。

表2 不同時間點(diǎn)各組轉(zhuǎn)染后A570值比較（）Table 2 The comparison on A570values after gene transfection for different time

表2 不同時間點(diǎn)各組轉(zhuǎn)染后A570值比較（）Table 2 The comparison on A570values after gene transfection for different time

組別2d 6d 10d對照1組0.583±0.0360.451±0.0390.429±0.031對照2組 0.549±0.0510.421±0.0870.403±0.028實(shí)驗(yàn)組 0.392±0.0470.294±0.0340.291±0.031 F 16.387 13.856 10.349 P 0.021 0.027 0.038

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)原代細(xì)胞獲取人角膜基質(zhì)細(xì)胞，通過免疫組織化學(xué)法以及MTT法檢測，生物顯微鏡攝取cyclinD1著染圖像，計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)分析，觀察反義cyclinD1轉(zhuǎn)染后，人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生情況的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后2、6、10d，反義cyclinD1轉(zhuǎn)染組A值以及A570值降低明顯，與其他兩組比較，差異有顯著性（P＜0.05）。但觀察時間延長，相關(guān)數(shù)值有所回升，提示陽離子脂質(zhì)體能夠介導(dǎo)人角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行反義cyclinD1轉(zhuǎn)染，外源基因表達(dá)具有時間限制，不能與宿主細(xì)胞基因組進(jìn)行整合，能夠滿足手術(shù)或創(chuàng)傷后進(jìn)行抑制基質(zhì)細(xì)胞增生的需求。MTT法檢測提示陽反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染能夠?qū)θ私悄せ|(zhì)細(xì)胞增生進(jìn)行抑制，而陽離子脂質(zhì)體對細(xì)胞增生不具有影響作用。Motkura等在1991年首次在甲狀旁腺腺瘤中克隆和鑒定出cyclinD1基因［5］。cyclinD1基因位于11q13染色體上，基因編碼區(qū)含有高含量GC，末端含有1個Poly－A區(qū)（由69個腺苷酸殘基組成），全長120kb，有5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，編碼蛋白共有295個氨基酸殘基，第56～141位氨基酸序列稱Cyclinbox，為保守序列［6］。cyclin D1是G1期細(xì)胞的細(xì)胞周期素，能夠調(diào)控G1／S轉(zhuǎn)換，目前相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)cyclinD1協(xié)同Rb基因，控制CyclinD1－CDK4復(fù)合物形成，共同對G1期進(jìn)程進(jìn)行調(diào)控［7］。CyclinD1是已知的重要細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)聯(lián)［8～10］，而隨著研究的不斷深入以及基因治療在眼科治療的新思路，反義基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行抑制細(xì)胞增生的研究逐漸成為臨床研究的熱點(diǎn)［11，12］。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染能夠抑制細(xì)胞增生，但是關(guān)于人角膜基質(zhì)細(xì)胞反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染后，RNA水平上的cyclinD1變化仍需進(jìn)一步探討和揭示。

4 結(jié)論

反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染，一定時間內(nèi)降低cyclinD1表達(dá)，抑制人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生，是角膜過度愈合反應(yīng)的基因治療的基礎(chǔ)。

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