于 鵬，劉靜雯

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

根據(jù)Bruun(1959)的深海生態(tài)區(qū)劃，海洋冷水圈的年平均溫度在10℃到5℃之間。這種環(huán)境是一個(gè)潛在的微生物多樣性的寶庫，有革蘭陰性菌(如假交替單胞菌屬、莫拉克斯氏菌屬、嗜冷菌屬、嗜冷彎曲菌屬、極地桿菌屬和假單胞菌屬等)，革蘭陽性菌(如節(jié)細(xì)菌屬、芽胞桿菌屬和微球菌屬等)，古生菌(如產(chǎn)甲烷菌屬、球菌屬和鹽紅菌屬等)，酵母菌(假絲酵母屬和隱球菌屬)，真菌(青霉菌屬和枝孢屬)。根據(jù)生長溫度的不同，海洋冷水圈微生物又被分為兩大類:嗜冷微生物(最適生長溫度低于15℃)和適冷微生物(最適生長溫度在20～25℃左右)。近年來，人們在極地微生物代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多具有重要應(yīng)用價(jià)值的適冷酶，主要有 α-淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、β-半乳糖苷酶和植酸酶等。由于適冷酶在食品行業(yè)(果膠酶、β-半乳糖甘酶)［1-2］、飼料行業(yè)(植酸酶)［3］、紡織品的生物拋光和石洗以及洗滌行業(yè)(脂肪酶、α-淀粉酶和纖維素酶)［4-6］具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，世界各國已經(jīng)加大了對(duì)工業(yè)適冷酶研究的支持力度。此外，有些適冷酶在生物修復(fù)(比如氧化酶)和生物轉(zhuǎn)化(甲基化酶和轉(zhuǎn)氨酶)方面的應(yīng)用也已經(jīng)取得了成功。

1 適冷酶的結(jié)構(gòu)特征

酶在低溫環(huán)境中活化能較低，而適冷酶能夠通過柔韌性的結(jié)構(gòu)彌補(bǔ)活化能的不足。與同類嗜溫酶和嗜熱酶相比，適冷酶表現(xiàn)為較低的活化焓(△H#)和活化熵(△S#)，當(dāng)溫度降低時(shí)，適冷酶的反應(yīng)速率往往會(huì)下降得更慢，這種熱力學(xué)活化參數(shù)能夠轉(zhuǎn)化為酶在低溫下相對(duì)較高的催化活性(Kcat)和結(jié)構(gòu)柔韌性。

通常熱不穩(wěn)定性適冷酶與穩(wěn)定性較高的同類嗜溫酶和嗜熱酶的結(jié)構(gòu)相差較大，這些結(jié)構(gòu)特征賦予了適冷酶高度的柔韌性。例如，適冷酶往往具有以下特征:核心疏水性降低，表面親水性增加，精氨酸與賴氨酸比例降低，域間和亞基間的相互作用減弱，環(huán)狀結(jié)構(gòu)多而長，二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)量減少，甘氨酸殘基數(shù)量增加，環(huán)狀結(jié)構(gòu)中脯氨酸殘基數(shù)量減少，α-螺旋中脯氨酸殘基數(shù)量增加，金屬離子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量減少，二硫橋數(shù)量減少，靜電相互作用減弱(氫鍵、鹽橋、芳香族-芳香族相互作用)等［7］。來自北極海冰細(xì)菌的鋅金屬蛋白酶，其氫鍵大量減少使得酶的結(jié)構(gòu)柔韌性得到提高［8］，表明適冷酶能夠通過特殊的方式使其具有結(jié)構(gòu)柔韌性。

2 酶篩選的新發(fā)現(xiàn)

目前主要通過平板篩選和宏基因組文庫技術(shù)獲得新的適冷酶。

通過選擇性培養(yǎng)基篩選的方法從環(huán)境樣品中分離產(chǎn)酶微生物，從而發(fā)現(xiàn)了許多新的適冷酶，如果膠酶［1］、植酸酶［3］和 α-淀粉酶［5］等。最近作者利用植酸酶篩選培養(yǎng)基(PSM)從南極海底沉積物樣品中分離到10株低溫植酸酶產(chǎn)生菌。其中一株酵母菌在PSM平板上于4℃條件下培養(yǎng)3周便出現(xiàn)明顯水解圈(圖1A)。另一株酵母菌經(jīng)鑒定為紅酵母屬(Rhodotorula sp.)，在15℃培養(yǎng)1周出現(xiàn)明顯水解圈，而在4℃下需要較長時(shí)間(圖1B)。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，其37℃酶活大約提高了 3 倍，達(dá)到 207.935 U/mL。

圖1 酵母菌株JMUY17和JMUY14菌落及其透明圈Fig.1 The colonies of strain JMUY17 and JMUY14 on solid agar

A:JMUY17的菌落及其透明圈(15℃)B:JMUY14的菌落及其透明圈(4℃)

通過基于功能的酶篩選，如瓊脂試驗(yàn)和微滴定板試驗(yàn)，可以從宏基因組文庫中鑒定出一些具有潛在生物技術(shù)應(yīng)用的酶的基因。目前已從潮間帶沉積物［9］、北極海底沉積物［10］等生境中發(fā)現(xiàn)了新的適冷脂肪酶和酯酶。在潮間帶沉積物樣品中篩選出一種新的適冷堿性脂肪酶，其最適溫度為30℃，除了保守區(qū)域外，它與已知的脂肪酶基本上不存在氨基酸序列相似性，說明其屬于脂解酶的一個(gè)新家族［9］。從南極土壤篩選到的一種新的纖維素酶缺少部分纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且具有較高的底物特異性，只能將羧甲基纖維素分解為纖維二糖和纖維三糖［11］。以 O-硝基苯基-β-D-半乳糖苷為底物，從油田土壤構(gòu)建的宏基因組文庫篩選到3個(gè)β-半乳糖苷酶基因，其中一種為適冷酶并且在畢赤酵母中顯示了較高的表達(dá)水平，在烘焙行業(yè)具有巨大的應(yīng)用潛力［12］。

此外，還可通過其他方法獲得新的適冷酶基因。利用根據(jù)基因的保守序列設(shè)計(jì)的簡并引物，從南極海灣的沉積物中獲得一個(gè)烷烴單氧酶基因［13］，其基因序列與已知的基因序列同源性相比較低(＜75%)。使用鳥槍測序法可以從環(huán)境樣品中獲得大量基因序列，對(duì)其進(jìn)行分析能夠快速篩選出大量潛在的目的基因。如通過對(duì)北極永久凍土宏基因組文庫進(jìn)行分析得到了海藻糖酶、幾丁質(zhì)酶、β-葡糖苷酶和 β-半乳糖苷酶的基因［14］。

3 適冷酶的改造與低溫表達(dá)系統(tǒng)

適冷酶在低溫下催化效率較高，因此在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。為了獲得較高的催化效率，適冷酶的構(gòu)象柔性明顯增強(qiáng)，然而這會(huì)導(dǎo)致其穩(wěn)定性的下降，在某種程度上阻礙了其在工業(yè)中的應(yīng)用。如能不影響適冷酶低溫下的催化效率使其穩(wěn)定性增強(qiáng)，它們將會(huì)發(fā)揮更大的應(yīng)用潛力。

目前主要通過基因工程的方法提高低溫酶的活性和熱穩(wěn)定性。采用定點(diǎn)突變的方法能夠增強(qiáng)適冷弧菌絲氨酸蛋白酶(VPR)的熱穩(wěn)定性，突變體的T(50%)和T(m)都提高了大約3℃，而且酶的活性也得到了提高。進(jìn)一步研究表明，去掉VPR中同類嗜熱酶不具有的C-末端擴(kuò)展序列的15個(gè)殘基，酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步得到改善。這闡明了如何通過比較適冷菌和嗜溫菌/嗜熱菌的蛋白酶的結(jié)構(gòu)來改善蛋白酶的品質(zhì)［15］。采用同樣的技術(shù)，對(duì)吉氏芽胞桿菌堿性蛋白酶(BgAP)進(jìn)行3輪定點(diǎn)突變，將替換的氨基酸進(jìn)行重新組合得到突變體MF1。然后結(jié)合優(yōu)化的微量滴定板表達(dá)系統(tǒng)和傳統(tǒng)的蛋白水解檢測方法進(jìn)行高通量篩選，在文庫中篩選出58℃孵育后蛋白水解活性增強(qiáng)的突變體。與野生型相比，其活性(15℃)提高了1.5倍，在60℃的半衰期延長了超過100倍［16］。來自適冷銅綠假單胞菌的LipC能夠承受高濃度的離子和重金屬，并且在較高溫度下底物特異性會(huì)發(fā)生改變，但是較低的溫度耐受性限制了其在工業(yè)流程中的應(yīng)用。通過合理設(shè)計(jì)，使用飽和誘變的方法使LipC的熱穩(wěn)定性提高了7倍［17］。這些研究表明改善酶的一種特性(活性/穩(wěn)定性)而不影響酶的其他特性是可行的。在工業(yè)生產(chǎn)中，為了獲得較好的經(jīng)濟(jì)效益，可以通過培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件的優(yōu)化提高酶的產(chǎn)量。通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，菌株Kurthia CZC0806的低溫植酸酶活性達(dá)到了 103.11 U/mL［18］。此外，還可以通過酶基因的克隆表達(dá)來獲得大量適冷酶。低溫表達(dá)系統(tǒng)具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，其優(yōu)勢在于:①能夠維持熱不穩(wěn)定性適冷酶的穩(wěn)定性，從而有利于適冷酶的純化;②低溫表達(dá)能夠減少包涵體，從而有利于可溶性蛋白的生產(chǎn);③低溫表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建將會(huì)進(jìn)一步推動(dòng)嗜冷菌宿主基因操作方面的研究?，F(xiàn)已將嗜冷微生物自身的質(zhì)粒應(yīng)用于低溫表達(dá)系統(tǒng)。如使用南極油螺旋菌屬細(xì)菌的groEL構(gòu)建的大腸埃希菌低溫表達(dá)系統(tǒng)，能夠使大腸埃希菌在低溫下較好地生長和過量表達(dá)蛋白［19］。

4 適冷酶在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用

適冷酶在低溫下具有較高的Km和Kcat，當(dāng)溫度升高時(shí)又極易變性失活并且能夠在有機(jī)溶劑中發(fā)揮作用，這些特性使其在生物工藝中得到廣泛應(yīng)用。在低溫下，適冷酶比同類嗜溫酶和嗜熱酶催化效率更高，因此能夠節(jié)約能源，帶來更高的經(jīng)濟(jì)效益。在低溫環(huán)境的蚯蚓體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種適冷纖維素酶復(fù)合體既具有內(nèi)源-β-1，4-D-葡聚糖酶活性，又具有β-1，4-葡糖苷酶活性，因此能夠?qū)⒗w維素直接轉(zhuǎn)化為葡萄糖。纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇一般需要相對(duì)較高的溫度(50～60℃)，從而大大增加能耗和生產(chǎn)成本，而使用酵母菌發(fā)酵得到的適冷纖維素酶復(fù)合體能夠在低溫下直接利用纖維素大量生產(chǎn)乙醇［20］。這是在低溫下使用纖維素廢棄物進(jìn)行生物燃料高效生產(chǎn)的重大進(jìn)步。植酸酶可以在不同的膳食環(huán)境中有效提高植酸鹽-磷在單胃動(dòng)物體內(nèi)的利用率，改善無機(jī)物的生物有效性，不僅可以添加到動(dòng)物飼料中，在人類營養(yǎng)中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Huang等［21］將歐文菌植酸酶的基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，與同類嗜溫植酸酶相比，不但在低溫下具有較高的活性，而且具有較低的Km和較高的Kcat，在動(dòng)物飼料添加劑中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在10～60℃范圍內(nèi)，使用純化的適冷蛋白酶去除絲綢上的茶漬(包含蛋白)，結(jié)果顯示，在低溫下洗滌效果非常好，說明這種酶能夠用于一些對(duì)高溫敏感的精美纖維織物的洗滌［22］。此外，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用來自乳酸克魯維酵母的適冷β-D-半乳糖苷酶能夠降低常溫菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可以在乳糖水解工業(yè)中節(jié)約能源，提高經(jīng)濟(jì)效益［23］。適冷酶潛在的生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用見表1。

目前適冷酶主要應(yīng)用于洗滌行業(yè)。從洗滌劑生產(chǎn)廠家了解到，當(dāng)洗滌溫度從40℃降到30℃時(shí)，能耗降低30%，相當(dāng)于每洗滌1次能夠減少100 g CO2的排放。建筑物、地毯和長椅等物品表面往往需要使用噴霧劑或濕巾來清洗，其中在建筑物清潔劑中添加脂肪酶和葡萄糖水解酶能夠明顯提高石頭上霉菌的去除效率，還可以減輕使用常規(guī)清潔劑所造成的損壞，為適冷酶的使用提供了很好的途徑［28］。在食品加工行業(yè)的設(shè)備清洗過程中，清洗后殘余的酶可能會(huì)導(dǎo)致食品變質(zhì)，使得酶的應(yīng)用受到很大限制。而適冷酶具有相對(duì)較高的熱不穩(wěn)定性，可以通過熱水漂洗使其活性降到最低，而且使用適冷酶能夠減少低溫(生產(chǎn))與中高溫 (清洗)之間的重復(fù)次數(shù)，從而節(jié)約能源，縮短停機(jī)時(shí)間。因此適冷酶可以作為洗滌添加劑應(yīng)用于食品加工行業(yè)。此外，洗滌劑中通常包含有機(jī)溶劑，如超過四分之一的乳制品、食品和工業(yè)洗滌劑中含有乙醇，則適冷酶的溶劑耐受性即能在洗滌過程中發(fā)揮重要作用。在許多行業(yè)，酶在改善洗滌劑的洗滌效果和提高環(huán)境可持續(xù)性方面發(fā)揮了巨大作用。目前適冷酶已經(jīng)成功應(yīng)用于一些行業(yè) (如食品行業(yè))的洗滌劑中，并且在其他領(lǐng)域 (如膜過濾工業(yè)和石油工業(yè))也具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著宏基因組文庫篩選技術(shù)和酶工程技術(shù)的發(fā)展，適冷酶的新特性(在低溫下高活性、能夠熱失活的熱不穩(wěn)定性和溶劑耐受性)也將在洗滌行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。

表1 適冷酶潛在的生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用Table 1 Selected potential biotechnological applications of cold-adapted enzymes

5 展望

由于低溫酶生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低，且熱穩(wěn)定性較差，因此低溫酶的工業(yè)應(yīng)用仍存在局限性。為能將低溫酶大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，當(dāng)前低溫酶的研究主要集中在基礎(chǔ)研究及酶的改良等方面。第一，在低溫環(huán)境中發(fā)現(xiàn)和鑒定可培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的新菌株，低溫酶是其適應(yīng)這種極端環(huán)境的主要特征，將這些酶分離純化、克隆來進(jìn)一步了解其低溫適應(yīng)性，評(píng)估其潛在的生物技術(shù)應(yīng)用;第二，培養(yǎng)基的組成成分和發(fā)酵條件對(duì)低溫微生物產(chǎn)酶影響很大，目前主要通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)等方法進(jìn)行條件優(yōu)化以提高適冷酶的產(chǎn)量，同時(shí)研究人員正在努力尋找成本效益更好的培養(yǎng)基，固態(tài)發(fā)酵的方法也已經(jīng)用于某些適冷酶的生產(chǎn);第三，適冷酶的一個(gè)主要缺陷在于熱穩(wěn)定性較差，可以通過在環(huán)境中篩選適于工業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)酶微生物或通過傳統(tǒng)誘變以及重組DNA技術(shù)改善菌株的方法解決。定點(diǎn)突變技術(shù)能夠用于檢測適冷酶在低溫適應(yīng)性中是否發(fā)生了氨基酸的置換，還可用于改善酶的性能(如活性和穩(wěn)定性)，有時(shí)為了尋找酶的熱穩(wěn)定性和比活力之間的平衡還要用到協(xié)同突變技術(shù)。此外，可以通過基因組序列探索低溫微生物在低溫適應(yīng)性方面存在共同特征，或是每種微生物都有自己獨(dú)特的方式，而為了研究調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)與環(huán)境溫度之間的關(guān)系，還有賴于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步。

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