祁贊梅，楊 冀，韓 雪，張婭琳，趙國(guó)明，曹雅明

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

瘧疾是嚴(yán)重威脅人類健康的寄生原蟲感染性疾?。?］。在瘧原蟲誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，前炎癥反應(yīng)與抗炎因素的平衡是清除寄生蟲感染并避免產(chǎn)生病理反應(yīng)的重要基礎(chǔ)［2-3］。白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是建立這種平衡過程中具有重要免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵細(xì)胞因子［3］。大量臨床研究顯示，瘧疾所導(dǎo)致的嚴(yán)重貧血與患者血漿中較低的IL-10水平有關(guān)，而高原蟲血癥及部分腦瘧患者具有較高的血漿IL-10水平［4-8］。因此，IL-10水平異常與瘧疾臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，了解瘧疾免疫應(yīng)答過程中IL-10的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于研究瘧疾免疫應(yīng)答調(diào)控以及預(yù)防和治療臨床并發(fā)癥具有重要意義。2002年Bhan及其同事［9］首次證實(shí)產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞能夠抑制炎癥反應(yīng)，并將其稱為調(diào)節(jié)性 B細(xì)胞(regulatory T cells，Bregs)。Bregs的關(guān)鍵特性是產(chǎn)生IL-10，尚未發(fā)現(xiàn)Bregs獨(dú)有的表面分子或標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子，其分化來(lái)源和機(jī)制也未闡明［10］。Bregs的主要生物學(xué)作用包括，通過與T細(xì)胞的同源相互作用和釋放IL-10抑制Th1和Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［10-11］;參與維持Tregs的數(shù)量和功能［11］;分化為產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞［12］。Bregs的上述生物學(xué)作用使其在自身免疫性疾病、移植、腫瘤和部分感染性疾病中的作用逐漸受到重視，但目前對(duì)Bregs在瘧疾免疫應(yīng)答中的作用尚缺少了解。本研究利用P.c AS感染的小鼠模型，觀察了瘧疾免疫應(yīng)答過程中Bregs數(shù)量變化和表型特點(diǎn)，以期探討B(tài)regs在瘧疾免疫調(diào)節(jié)中的作用地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘧原蟲感染模型 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠(購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司)經(jīng)腹腔感染1×106P.c As寄生的紅細(xì)胞(Parasitized Red Blood Cell，pRBC)，感染不同時(shí)間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.1.2 主要儀器及試劑 流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，BI);CD16/32 封閉抗體(93 克隆)、抗CDld-FITC單抗(1B1克隆)、抗 IL-10-PE單抗(JES5-16E3克隆)、抗CD19-PE/cy5單抗(6D5克隆)、抗 CD5-APC 單抗(53-7.3克隆)、抗 CD4-APC單抗(GK1.5克隆)及其相關(guān)熒光標(biāo)記同種型對(duì)照購(gòu)于Biolegend公司;固定透膜液(Fixation and Permeabilization Solution)購(gòu)于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 在感染后第0、3、5、8天處死小鼠，取少量脾組織，使用Trizol試劑提取總RNA，按PrimeScript RT Reagent Kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取100 ng RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按SYBR Premix Ex Ta試劑盒說明書配制20 μL PCR體系，于Corbett Rotor-Gene 6000(Corbett Life Science，Australia)實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)過程:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。使用核糖體 S17蛋白(RPS17)作為內(nèi)參，利用兩倍系列稀釋樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用的特異性引物序列如下:RPS17 F:5'-TGTCGGGATCCACCTCAATG-3';RPS17R:5'-CGCCATTATCCCCAGCAAG-3';IFN-γ F:5'-AAAGACAATCAGGCCATCAG-3';IFN-γ R:5'-TGGGTTGTTGACCTCAAACT-3';IL-10F:5'-CAGTACAGCCGGGAAGACA-3';IL-10 R:5'-GCATTAAGGAGTCGGTTAGCA-3'。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 感染后第0、3、5、8天取小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。脾細(xì)胞在添加PMA(50 ng/mL)、LPS(10 μg/mL)、Ionomycin(1 μg/mL)及 Monensin(20 μmol/L)的含 10%胎牛血清 (FCS)的RPMII 1640刺激培養(yǎng)5 h。取1×106脾細(xì)胞，用含2%BSA的PBS洗滌后，加入FcR III/II封閉20 min，然后加入特異性熒光抗體或相應(yīng)同種型對(duì)照抗體進(jìn)行多重表面染色。在表面染色后，固定透膜，加入抗IL-10單抗進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。用固定透膜液充分洗滌后，重懸于0.5 mL 1%多聚甲醛中。流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，使用WINMID2.9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，t檢驗(yàn)比較分析組內(nèi)和組間均值的顯著性差異。P﹤0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.c AS感染后小鼠紅細(xì)胞感染率和脾細(xì)胞因子 IL-10、IFN-γmRNA 水平變化

P.c AS感染小鼠于感染后第5天在外周血中出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞，隨后，原蟲血癥水平持續(xù)升高，于感染后第9天達(dá)到30%左右，并出現(xiàn)大量死亡，在感染后第10天全部死亡;脾組織細(xì)胞因子IL-10 mRNA水平在感染后第3天明顯升高，在感染后第5天達(dá)到高峰，此后緩慢下降，感染后第8天仍為未感染小鼠的10倍左右。IFN-γ mRNA水平在感染后3～5 d有小幅上升，約為未感染小鼠的5倍左右，感染后第8天恢復(fù)到正常水平。

圖1 BALB/c小鼠感染P.c AS后的原蟲血癥水平(A)和脾細(xì)胞因子IL-10、IFN-γ mRNA水平(B)變化Fig.1 The changes of parasitaemia(A)and the splenic mRNA levels of IL-10、IFN-γ(B)of BALB/c mice infected with P.c AS

2.2 P.c AS 感染后脾細(xì)胞中 CD19+IL-10+、CD4+IL-10+細(xì)胞百分比和絕對(duì)數(shù)量比較

P.c AS感染后第3天，脾中CD19+細(xì)胞和CD4+細(xì)胞中IL-10+細(xì)胞百分比均出現(xiàn)有意義的升高。CD4+細(xì)胞中IL-10+細(xì)胞百分比在感染后第5天達(dá)到高峰，約占CD4+細(xì)胞的15%，感染后第8天回落至正常水平附近;CD19+細(xì)胞中IL-10+細(xì)胞百分比在感染后持續(xù)上升，至感染后第8天達(dá)到5%左右，未見回落趨勢(shì)。CD19+IL-10+、CD4+IL-10+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量變化趨勢(shì)與百分比變化趨勢(shì)相似，感染后第5天內(nèi)CD4+IL-10+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量高于CD19+IL-10+細(xì)胞數(shù)量，但感染后第8天，CD19+IL-10+細(xì)胞數(shù)量達(dá)到CD4+IL-10+細(xì)胞數(shù)的5倍左右。

圖2 BALB/c小鼠感染P.c AS后脾內(nèi)CD4+和CD19+細(xì)胞中IL-10+細(xì)胞百分比變化(A)和絕對(duì)數(shù)量比較(B)Fig.2 The changes of the persentage of IL-10+cells in the splenic CD4+and CD19+cells and(A)the comparasion of their absolute numbers(B)in P.c AS-infected BALB/c mice

2.3 CD19+IL-10+Bregs表型分析

P.c AS感染后第8天，脾細(xì)胞中IL-10+細(xì)胞約占脾細(xì)胞總數(shù)的2%，其中80%以上為CD4－CD19loBregs細(xì)胞。對(duì)CD19loIL-10+Breg表面CD5和CD1d的分析顯示，約90%的CD19loIL-10+Bregs為CD5－細(xì)胞，其中一半以上為CD1d+細(xì)胞。

圖3 P.c AS感染后第8天BALB/c小鼠脾內(nèi)IL-10+細(xì)胞表面分子的表達(dá)分析Fig.3 The expression of surface molecules on IL-10+cells in the spleen from BALB/c mice at day 8 post P.c AS infection

3 討論

由于IL-10來(lái)源復(fù)雜，作用多樣，目前對(duì)IL-10在瘧疾免疫應(yīng)答中的活化及其調(diào)節(jié)機(jī)制知之甚少。能夠產(chǎn)生IL-10的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)曾被認(rèn)為在瘧疾免疫調(diào)節(jié)中扮演關(guān)鍵角色，但研究顯示，Tregs只能部分地抑制保護(hù)性Th1應(yīng)答，并且在抑制免疫病理?yè)p傷方面的作用有限［13-14］。另有研究顯示，約氏瘧原蟲感染的小鼠模型中，IL-10在Tregs的免疫調(diào)節(jié)功能中并不起主要作用［15］。

本研究顯示，P.c AS感染后脾組織 IL-10 mRNA水平隨原蟲血癥的升高而不斷上升，在感染初期的0～5 d內(nèi)，T細(xì)胞是IL-10的主要來(lái)源，但其后，CD19+B細(xì)胞取代T細(xì)胞成為主要的IL-10產(chǎn)生細(xì)胞。在約氏瘧原蟲感染的小鼠中也觀察到類似的結(jié)果。由此可知，Bregs在鼠瘧模型中大量活化，是感染中后期IL-10的主要來(lái)源，但是此前Bregs的作用一直沒有得到足夠認(rèn)識(shí)。Bao等［16］在反復(fù)藥物治愈的對(duì)腦瘧有抵抗作用的小鼠中發(fā)現(xiàn)，感染后第7天，血漿IL-10水平顯著高于對(duì)照組，顯著增高的IL-10+淋巴細(xì)胞亞群是CD19+細(xì)胞，被動(dòng)轉(zhuǎn)移脾CD19+B細(xì)胞可保護(hù)小鼠不發(fā)生腦瘧。Liu等［17］的研究也顯示過繼轉(zhuǎn)移Bregs而非Tregs對(duì)腦瘧的發(fā)生有抑制作用。這些結(jié)果都顯示，Bregs在瘧疾免疫應(yīng)答過程中可能發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用。

目前研究較多的小鼠脾中Bregs為B10細(xì)胞，其較為公認(rèn)的表型為 CD19+CD5+CD1dhi［9］。雖然有研究顯示伯氏瘧原蟲感染過程中有B10細(xì)胞的擴(kuò)增［17］，但 Bao 等［16］的研究顯示反復(fù)藥物治愈的伯氏瘧原蟲感染小鼠中，高水平血漿IL-10的主要來(lái)源是CD5－CD19+細(xì)胞。本研究也顯示，夏氏瘧原蟲感染后第8天脾中分泌IL-10細(xì)胞主要為CD5－Bregs。這些結(jié)果提示，瘧疾模型中Bregs的表型和功能具有特殊性，有必要進(jìn)行更深入研究。

［1］World Health Organiztion.World Malaria Report 2012.http://www.who.int/malaria/publications/world_malaria_report_2012/en/index.html

［2］Taylor-Robinson AW，Phillips RS，Severn A，et al.The role of TH1 and TH2 cells in a rodent malaria infection［J］.Science，1993，260(5116):1931-1934.

［3］Freitas do Rosario AP，Langhorne J.T cell-derived IL-10 and its impact on the regulation of host responses during malaria［J］.Int J Parasitol，2012，42(6):549-555.

［4］Rovira-Vallbona E，Moncunill G，Bassat Q，et al.Low antibodies against Plasmodium falciparum and imbalanced pro-inflammatory cytokines are associated with severe malaria in Mozambican children:a case-control study［J］.Malar J，2012，11:181.

［5］Boeuf PS，Loizon S，Awandare GA，et al.Insights into deregulated TNF and IL-10 production in malaria:implications for understanding severe malarial anaemia［J］.Malar J，2012，11(1):253.

［6］Noone C，Parkinson M，Dowling DJ，et al.Plasma cytokines，chemokines and cellular immune responses in pre-school Nigerian children infected with Plasmodium falciparum［J］.Malar J，2013，12(1):5.

［7］Zhang G，Manaca MN，McNamara-Smith M，et al.Interleukin-10(IL-10)polymorphisms are associated with IL-10 production and clinical malaria in young children［J］.Infect Immun，2012，80(7):2316-2322.

［8］Thuma PE，van Dijk J，Bucala R，et al.Distinct clinical and immunologic profiles in severe malarial anemia and cerebral malaria in Zambia［J］.J Infect Dis，2011，203(2):211-219.

［9］Mizoguchi A，Mizoguchi E，Takedatsu H，et al.Chronic intestinal inflammatory condition generates IL-10-producing regulatory B cell subset characterized by CD1d upregulation［J］.Immunity，2002，16(2):219-230.

［10］Mauri C，Bosma A.Immune regulatory function of B cells［J］.Annu Rev Immunol，2012，30:221-241.

［11］Yoshizaki A，Miyagaki T，DiLillo DJ，et al.Regulatory B cells control T-cell autoimmunity through IL-21-dependent cognate interactions［J］.Nature，2012，491(7423):264-268.

［12］Maseda D，Smith SH，DiLillo DJ，et al.Regulatory B10 cells differentiate into antibody-secreting cells after transient IL-10 production in vivo［J］.Immunol，2012，188(3):1036-1048.

［13］Hansen DS，Schofield L.Natural regulatory T cells in malaria:host or parasite allies［J］.PLoS Pathog，2010，6(4):e1000771.

［14］Steeg C，Adler G，Sparwasser T，et al.Limited role of CD4+Foxp3+regulatory T cells in the control of experimental cerebral malaria［J］.Immunol，2009，183(11):7014-7022 .

［15］Abel S，Lückheide N，Westendorf AM，et al.Strong impact of CD4+Foxp3+regulatory T cells and limited effect of T cell-derived IL-10 on pathogen clearance during Plasmodium yoelii infection［J］.Immunol，2012，188(11):5467-5477.

［16］Bao LQ，Huy NT，Kikuchi M，et al.CD19(+)B cells confer protection against experimental cerebral malaria in semi-immune rodent model［J］.PLoS One，2013，8(5):e64836.

［17］Liu Y，Chen Y，Li Z，et al.Role of IL-10-producing regulatory B cells in control of cerebral malaria in Plasmodium berghei infected mice［J］.Eur J Immunol，2013，43(11):2907-2918.