李靜，王俏俏，徐年軍＊，孫雪，范美華

（1.寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波315211；2.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波，315211）

1 引言

龍須菜Gracilarialemaneifor mis是一種重要的產(chǎn)瓊膠大型經(jīng)濟(jì)海藻。由于其具有較強(qiáng)吸收氮、磷的能力，可用于推廣栽培來修復(fù)富營養(yǎng)化海水和減輕海區(qū)養(yǎng)殖污染［1］。龍須菜中的多糖和蛋白含有多種營養(yǎng)成分和免疫活性物質(zhì)，可作為海洋藥物資源和名貴海產(chǎn)品鮑魚的餌料［2］。龍須菜原產(chǎn)于山東半島，如今在我國南部的福建和廣東等海域也有大規(guī)模栽培［3］，高溫脅迫是龍須菜栽培面臨的關(guān)鍵問題。

油菜素內(nèi)酯是一種新型植物激素，在植物體內(nèi)含量微少，而且提取成本高、工藝復(fù)雜［4］，人工合成油菜素內(nèi)酯成為世界各地有機(jī)化學(xué)專家研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)合成20多種油菜素甾醇類化合物，其中以油菜甾醇為原料大規(guī)模合成24－表油菜素內(nèi)酯和高油菜素內(nèi)酯應(yīng)用于研究生產(chǎn)［5］。24－表油菜素內(nèi)酯作為人工合成的油菜素內(nèi)酯類似物，有著和油菜素內(nèi)酯一樣極高的生理活性，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。研究證明，24－表油菜素內(nèi)酯可以改善植物生理代謝功能，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多過程，如促進(jìn)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)藻細(xì)胞分裂、有機(jī)物累積，微觀組織分化等，從而提高植物的品質(zhì)和產(chǎn)量。在高溫、高鹽度、重金屬等逆境下能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理生化環(huán)境，促進(jìn)其恢復(fù)正常的生理代謝過程，增強(qiáng)植物的抗逆性［6］。

本文根據(jù)龍須菜栽培過程中對(duì)高溫的不適應(yīng)性，測(cè)定高溫脅迫下不同濃度24－表油菜素內(nèi)酯處理組龍須菜的生長(zhǎng)速率、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)甘露醇含量、氧化產(chǎn)物丙二醛含量、藻膽蛋白含量、蛋白質(zhì)合成伴侶熱激蛋白70基因（HSP70）表達(dá)量、抗氧化酶谷胱甘肽還原酶基因（GR）表達(dá)量以及光合色素藻紅蛋白基因（PE）表達(dá)量的變化。研究24－表油菜內(nèi)酯對(duì)高溫脅迫下龍須菜的生理及分子水平影響，探討24－表油菜素內(nèi)酯對(duì)提高龍須菜抵抗高溫逆境能力的作用機(jī)制。

2 材料與方法

2.1 材料

供試材料為龍須菜981品系，采于福建寧德，實(shí)驗(yàn)室保種培養(yǎng)1個(gè)月以上。將2 mg 24－表油菜素內(nèi)酯（Sigma）溶于2 mL 95%乙醇中配成母液，充分搖勻后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 處理方法

于培養(yǎng)瓶中分別加入等量龍須菜和不同量的24－表油菜素內(nèi)酯母液，配制成0、0.004、0.02、0.1、0.5 mg／L 5個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度3次平行，其中0濃度為對(duì)照組。常溫下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行31℃高溫脅迫。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度40μmol／（m2·s），鹽度25，光周期L∶D（12 h∶12 h），每隔3 d加一次Provasoli培養(yǎng)基。生理實(shí)驗(yàn)分別于高溫脅迫第0～6 d的同一時(shí)間點(diǎn)取樣，樣品用去離子水快速?zèng)_洗后吸干水分，液氮快速處理后于－20℃保存，冷凍干燥后備用。分子實(shí)驗(yàn)分別于高溫脅迫第24 h、48 h的同一時(shí)間點(diǎn)取樣，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 生長(zhǎng)速率測(cè)定

通過測(cè)定龍須菜培養(yǎng)6 d后藻體鮮質(zhì)量的變化來計(jì)算龍須菜的相對(duì)生長(zhǎng)速率RGR［7］：

式中，W0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)藻的鮮質(zhì)量，單位是g，Wt為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)藻的鮮質(zhì)量，單位是g，t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)，單位是d。

2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

用水樣葉綠素?zé)晒鈨xMINI－PAM測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。實(shí)驗(yàn)組為0.1 mg／L處理組，對(duì)照組不添加24－表油菜素內(nèi)酯。測(cè)量前藻體先進(jìn)行暗適應(yīng)15 min，使用弱測(cè)量光測(cè)定F0，然后用飽和脈沖激發(fā)測(cè)出最大熒光值Fm。熒光參數(shù)PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)換效率（Fv／Fm）、實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率（ΦPSⅡ）、非光化學(xué)淬滅（NPQ）和光化學(xué)淬滅（q P）可以通過數(shù)據(jù)輸出直接獲得［8］。

2.5 抗氧化酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（A001）；植物過氧化物酶（POD）測(cè)定試劑盒（A084）均購自南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)過程按照試劑盒說明書操作。

2.6 甘露醇含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取干藻樣0.05 g，加入4 mL去離子水勻漿后3 000 r／min離心5 min。接著取2 mL上清液，加入3.75 mL 0.1 mol／L CuSO4溶液和2.5 mL 3.8 mol／L Na OH溶液，渦旋振蕩混勻后立即置于沸水浴中加熱5 min，待樣品冷卻，3 000 r／min離心5 min，取得上清液測(cè)定OD640。每個(gè)樣品取3個(gè)平行［8］。

2.7 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

采用硫酸巴比妥法測(cè)定，

根據(jù)提取液計(jì)算樣品中所含MDA的量，單位為μmol／g。

2.8 藻膽蛋白含量的測(cè)定

采用硫酸銨沉淀法測(cè)定，準(zhǔn)確稱取0.05 g干藻樣，液氮研磨。在離心管中加入4 mL l mol／L p H6.8的PBS，先離心得到粉紅色上清液，然后加入飽和度55%的硫酸銨充分?jǐn)噭?，放置于冰?℃下避光過夜，沉淀得藻膽蛋白粗提物，測(cè)定上清液在D565nm、D615nm、D650nm的值，具體計(jì)算方法參照朱招波等［8］。

2.9 HSP70、PE、GR基因的定量表達(dá)分析

龍須菜31℃不同時(shí)間處理后，液氮凍存研磨，用plant kit試劑盒提取RNA。然后用PrimeScriptTMReverse Transcriptase（takara公司）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成c DNA，－20℃保存。

RT－PCR所用的特異性引物為：HSP70正向引物（5’－ACCTCCACCTAAATCAAA－3’）和反向引物（5’－CTCAGCGTCAAGCAACTA－3’）；PE正向引物（5’－AGACGCTGTATCAGGAAT－3’）和反向引物（5’－AGCCATACGACGGTTACT －3’）；GR正向引物（5’－TACAACTGGGCAGAACGG－3’）和反向引物（5’AAACACTGCGGTGGGAAT－3’）；參照基因18s正向引物（5’－TGCCGCCACCGTTTACTG－3’）和反向引物（5’－ACCCGATTCAAACAAACCAA－3’）。

RT－PCR：反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）緩沖液12.5μL，正向和反向引物 （10μmol／L）各0.5μL，c DNA模版1μL，d H2O 10.5μL。儀器為Eppendorf熒光定量PCR儀。程序采用：95℃30 s（1 cycle）；然后40 cycle（95℃15 s，55℃30 s，68℃30 s），熒光信號(hào)收集；接著對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，程序?yàn)?5℃30 s，55℃30 s，95℃15 s（1 cycle），55～95℃，＋0.5℃／cycle。

2.10 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007、SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析.用one－way ANOVA檢驗(yàn)差異的顯著水平（p），設(shè)顯著水平為p＜0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜生長(zhǎng)速率的影響

藻體生長(zhǎng)是其生理過程的綜合表現(xiàn)。圖1顯示，實(shí)驗(yàn)過程中，龍須菜相對(duì)生長(zhǎng)速率隨著24－表油菜素內(nèi)酯處理濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)24－表油菜素內(nèi)酯濃度為0.1 mg／L時(shí)生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值3.36%，比對(duì)照組2.51%增加了36.64%，顯著高于其他濃度處理（p＜0.05）。說明高溫環(huán)境下添加適當(dāng)濃度的24－表油菜素內(nèi)酯有利于龍須菜生長(zhǎng)。

圖1 不同濃度24－表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜相對(duì)生長(zhǎng)速率的影響Fig.1 Effects of different concentration of 24－epibrassinolide on the RGR of G.lemaneifor mis under high temperature stress（mean±SD）

3.2 表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖2可知，龍須菜的熒光參數(shù)Fv／Fm、ΦPSⅡ、q P均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且經(jīng)24－表油菜素內(nèi)酯處理后各個(gè)熒光參數(shù)都有所提高。其中處理組和對(duì)照組的Fv／Fm在第一天均有所下降。第二天開始24－表油菜素內(nèi)酯處理組下降幅度減緩，比對(duì)照組減緩了5.72%。且在整個(gè)高溫脅迫實(shí)驗(yàn)過程中Fv／Fm都高于對(duì)照組。ΦPSⅡ和qP與Fv／Fm下降趨勢(shì)一致，從第二天開始24－表油菜素內(nèi)酯處理組下降幅度減緩，第二天比對(duì)照組分別減緩了25.81%、10.18%。NPQ與其他熒光參數(shù)不同，處理組和對(duì)照組都隨著高溫逆境時(shí)間的延長(zhǎng)大致呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。24－表油菜素內(nèi)酯處理組NPQ第二天、第三天分別上升了7.16%、17.32%，比對(duì)照組減緩了 6.71%、8.85%。由此可見，24－表油菜素內(nèi)酯能提高龍須菜的光合作用能力，從而增強(qiáng)其抗高溫逆境能力。

3.3 表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜抗氧化酶活性的影響

圖3a顯示，各組龍須菜SOD酶均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，前三天各組SOD酶活性持續(xù)上升，在3天均達(dá)到最大值，其中0.1 mg／L、0.02 mg／L處理組與對(duì)照組差異顯著（p＜0.05）。在下降過程中除0.004 mg／L處理組外其他各組均高于對(duì)照組。POD酶活性變化趨勢(shì)同SOD，如圖3（b），先逐步上升在第三天0.1 mg／L處理組POD活性達(dá)到最高，比對(duì)照組增加37.56%，與其他處理組差異顯著（p＜0.05）。第四天其他各組POD仍持續(xù)上升，但只有0.1 mg／L處理組與對(duì)照組差異顯著（p＜0.05）。實(shí)驗(yàn)后兩天各組POD均下降，但經(jīng)24－表油菜素內(nèi)酯處理的龍須菜POD活性仍高于對(duì)照組。推測(cè)表24－油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)龍須菜耐熱性提高與高溫下保持龍須菜體內(nèi)較高的抗氧化酶活性有關(guān)。

3.4 表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜甘露醇和丙二醛含量的影響

由圖4a可見，高溫下第一天對(duì)照組甘露醇含量下降，處理組相對(duì)于對(duì)照組都有不同程度的提高，且都和對(duì)照組差異顯著（p＜0.05）。第二、三天各處理組甘露醇含量都有增長(zhǎng)，第三天都達(dá)到最大值，其中0.1 mg／L比對(duì)照組增加了15.09%，與對(duì)照差異顯著（p＜0.05）。之后甘露醇含量開始下降，但處理組一直處于高于對(duì)照組水平。說明適當(dāng)濃度的24－表油菜素內(nèi)酯有利于龍須菜體內(nèi)甘露醇含量的積累。

由圖4b可見，高溫第一、二天各組龍須菜MDA大量積累，第三天0.1 mg／L和0.02 mg／L處理組MDA含量開始下降，分別比對(duì)照下降了20.76%、18.22%，與對(duì)照組差異極顯著（p＜0.01）。且在整體變化趨勢(shì)中對(duì)照組MDA含量一直高于處理組。說明高溫下添加24－表油菜素內(nèi)酯處理可以減緩MDA在藻體細(xì)胞內(nèi)的積累。

圖2 24－表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.2 Effects of 24－epibrassinolide on the chlorophyll fluorescence parameters of G.lemaneifor mis under high temperature（mean±SD）

圖3 不同濃度24－表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of different concentration of 24－epibrassinolide on antioxidant enzy mes activity of G.lemaneifor mis under high temperature stress（mean±SD）

3.5 表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜藻膽蛋白含量的影響

由圖5可知，藻紅蛋白在處理第一天，除了0.1 mg／L濃度處理組外，其他各組的都有所下降，各組藻紅蛋白含量在第三天達(dá)到最大值，其中0.1 mg／L處理組含量最高，比對(duì)照組高出31.18%，與對(duì)照組差異顯著（p＜0.05）。第三天之后各組藻紅蛋白含量雖然都在下降，但處理組均高于對(duì)照組。藻藍(lán)蛋白（PC）在處理第一天，除對(duì)照組和0.004 mg／L處理組有所下降外，其余各組含量均增加，其中0.1 mg／L處理組的藻藍(lán)蛋白比對(duì)照組多28.16%，與對(duì)照組差異顯著（p＜0.05）。第二含量均開始增加，除0.004 mg／L處理組外其他各組在第三天達(dá)到峰值后開始下降，但24－表油菜素內(nèi)酯處理組都高于對(duì)照組。

圖4 不同濃度24－表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜甘露醇和丙二醛含量的影響Fig.4 Effects of different concentration of 24－epibrassinolide on the mannitol and MDA content of G.lemaneifor mis under high temperature stress（mean±SD）

圖5 不同濃度24－表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白含量的影響Fig.5 Effects of different concentration of 24－epibrassinolide on the R－PE and R－PC content of G.lemaneifor mis under high temperature stress（mean±SD）

3.6 表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜HSP70、PE、GR基因表達(dá)的影響

圖6a顯示，24 h熱激處理后，HSP70基因表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，由高到低依次為：0.1 mg／L處理組、0.5 mg／L處理組、0.02 mg／L處理組、0.004 mg／L處理組、對(duì)照組，處理組表達(dá)量均高于對(duì)照組。如6b顯示，熱激處理48 h后，表達(dá)量由高到低依次為：0.1 mg／L處理組、0.02 mg／L處理組、0.5 mg／L處理組、0.004 mg／L處理組、對(duì)照組。該結(jié)果表明處理組HSP70基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組，且0.1 mg／L濃度與對(duì)照組差異顯著（p＜0.05）。

24 h熱激后PE基因相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)如圖7a，由高到低依次為：0.1 mg／L處理組、0.02 mg／L處理組、0.5 mg／L處理組、0.004 mg／L處理組、對(duì)照組，濃度為0.1 mg／L處理組表達(dá)量與除0.02 mg／L處理組外其他各組差異性顯著 （p＜0.05）。48 h熱激后的相對(duì)表達(dá)量如圖7b，由高到低依次為：0.1 mg／L處理組、0.5 mg／L處理組、0.02 mg／L處理組、0.004 mg／L處理組、對(duì)照組，同樣濃度為0.1 mg／L處理組表達(dá)量與對(duì)照組差異性顯著 （p＜0.05）。結(jié)果表明處理組PE基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組，在0.1 mg／L濃度最顯著。

圖6 不同濃度24－表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜HSP70基因相對(duì)表達(dá)的影響Fig.6 Effects of different concentration of 24－epibrassinolide on the relative expression of HSP70 of G.lemaneifor mis under high temperature（mean±SD）

龍須菜在熱激處理24 h后，不同處理組GR相對(duì)表達(dá)量情況如圖8a，由高到低依次為：0.1 mg／L處理組、0.5 mg／L 處 理 組、0.002 mg／L 處 理 組、0.004 mg／L處理組、對(duì)照組，濃度為0.1 mg／L處理組表達(dá)量最高，與對(duì)照組差異性顯著 （p＜0.05）。48 h熱激后，GR相對(duì)表達(dá)量情況如圖8b，由高到低依次為：0.1 mg／L處理組、0.5 mg／L處理組、0.02 mg／L處理組、0.004 mg／L處理組、對(duì)照組，以0.1 mg／L處理組表達(dá)最高，與對(duì)照組差異性顯著 （p＜0.05）。結(jié)果表明處理組GR基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組，在0.1 mg／L濃度最顯著。

圖7 不同濃度24－表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫下龍須菜PE基因相對(duì)表達(dá)的影響Fig.7 Effects of different concentration of 24－epibrassinolide on the relative expression of PE of G.lemaneifor mis under high temperature（mean±SD）

4 討論

高溫脅迫下，植物會(huì)打破體系原有的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致氧代謝失調(diào)，造成活性氧、丙二醛的積累，改變膜的透性，嚴(yán)重時(shí)對(duì)植物可造成致死性傷害［9］；藻體中的藻膽蛋白是PSⅡ捕光色素復(fù)合體，能夠直接吸收光能，作為天線色素參與光合作用，而且還可以作為藻體細(xì)胞的貯存蛋白，有利于藻類在自然界中的生存競(jìng)爭(zhēng)，但高溫極易導(dǎo)致藻體內(nèi)色素蛋白復(fù)合體PSⅡ失活，藻膽蛋白降解［10］，使逆境下藻類的光合活性降低，影響藻體生長(zhǎng)。

研究結(jié)果顯示油菜素內(nèi)酯能提高小球藻細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的合成量，從而促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)和生物量的合成［11］；表油菜素內(nèi)酯還能影響硅藻卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶，改善硅藻的生長(zhǎng)生理［12］；在油菜素內(nèi)酯對(duì)萊茵衣藻生物量積累和生長(zhǎng)速度影響的研究中發(fā)現(xiàn)，表油菜素內(nèi)酯能夠加速藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速度［13］；在高溫脅迫下用表油菜素內(nèi)酯處理甜瓜幼苗，結(jié)果提高了甜瓜幼苗抗氧化酶活性，加強(qiáng)其對(duì)光能的捕獲、轉(zhuǎn)換，促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，降低高溫脅迫的抑制作用［14］。

張慎好等研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)芽期用油菜素內(nèi)酯浸種能提高種子的發(fā)芽率并促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)、胚根生長(zhǎng)［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示添加24－表油菜素內(nèi)酯的處理組生長(zhǎng)速率均高于對(duì)照組，24－表油菜素內(nèi)酯提高了龍須菜的生長(zhǎng)速率。

曹云英和趙華發(fā)現(xiàn)表油菜素內(nèi)酯能夠增強(qiáng)稻苗體內(nèi)活性氧保護(hù)酶系統(tǒng)SOD和POD的活性和誘導(dǎo)其表達(dá)，有效減輕高溫對(duì)秧苗的傷害［16］。本實(shí)驗(yàn)中，SOD、POD均隨著高溫逆境時(shí)間的增加而呈先上升后下降的趨勢(shì)。高溫逆境剛開始時(shí)，龍須菜體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)受高溫逆境誘導(dǎo)而啟動(dòng)，隨著自由基的增多，酶的活性不斷上升以清除自由基，使其維持在平衡狀態(tài)。但處理組與對(duì)照組相比能顯著地提高龍須菜體內(nèi)的SOD、POD，尤其以0.1 mg／L和0.02 mg／L對(duì)龍須菜抗氧化酶的提高最為顯著，與對(duì)照差異顯著。且以0.1 mg／L 24－表油菜素內(nèi)酯處理的龍須菜SOD、POD活性最大。

高溫逆境下藻類的光合活性會(huì)降低［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)高溫逆境后，龍須菜的各個(gè)熒光參數(shù)Fv／Fm、ΦPSⅡ和q P均下降。但是經(jīng)過24－表油菜素內(nèi)酯處理后，各熒光參數(shù)的下降幅度都比對(duì)照要慢，說明添加24－表油菜素內(nèi)酯能在一定程度上改善高溫逆境下龍須菜的光合生理狀態(tài)。Fv／Fm下降說明高溫?fù)p傷PSⅡ反應(yīng)中心，而添加24－表油菜素內(nèi)酯能夠抑制高溫對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心的損傷，減緩高溫對(duì)光合作用原初反應(yīng)的抑制，減輕對(duì)光合電子傳遞過程的阻礙。高溫能影響藻細(xì)胞對(duì)碳的固定與同化，ΦPSⅡ在高溫下隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，而本實(shí)驗(yàn)中添加24－表油菜素內(nèi)酯能顯著提高PSⅡ?qū)嶋H光能轉(zhuǎn)化效率，提高光合能力。PSⅡ?qū)嶋H光能轉(zhuǎn)化效率光化學(xué)淬滅qp的下降說明用于進(jìn)行光合作用的電子減少，與ΦPSⅡ的下降相一致。24－表油菜素內(nèi)酯處理組與對(duì)照組相比q P值有了一定的提高，增強(qiáng)了光適應(yīng)狀態(tài)下PSⅡ進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)的能力。非光化學(xué)淬滅NPQ在高溫逆境下有所升高表明PSⅡ吸收的光能以熱的形式耗散的部分增多，避免過多光能損傷光合器官，保護(hù)藻體［18］，而24－表油菜素內(nèi)酯能在一定程度上顯著提高NPQ，從而更好地提高PSⅡ的熱耗散能力，保護(hù)藻體的光合結(jié)構(gòu)。

在一定脅迫范圍內(nèi)，植物能通過自身細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)出抵抗外界滲透脅迫的能力。甘露醇作為植物一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，不僅對(duì)細(xì)胞滲透壓起到調(diào)節(jié)作用，還對(duì)活性氧特別是O2－和·OH的產(chǎn)生有抑制作用，而且對(duì)已生成的·OH則有清除作用，對(duì)植物抗逆性有雙重作用［19］。有研究證明藻類能通過調(diào)節(jié)藻體內(nèi)甘露醇的含量來適應(yīng)滲透壓的改變［20］。本試驗(yàn)中0.10 mg／L的24－表油菜素內(nèi)酯處理組能顯著提高龍須菜在高溫下的甘露醇含量，甘露醇的積累不僅提高了龍須菜細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，而且通過清除·OH而使龍須菜免受高溫氧化傷害。

高溫逆境下，藻體活性氧自由基的積累會(huì)引起膜脂過氧化，而丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，研究中常以丙二醛含量來反映植物膜脂過氧化水平和對(duì)細(xì)胞膜的傷害程度，其含量大小與逆境的耐性密切相關(guān)。張?jiān)妊芯空J(rèn)為高溫逆境會(huì)提高壇紫菜體內(nèi)的丙二醛含量，引起膜脂過氧化［21］。本實(shí)驗(yàn)中，龍須菜體內(nèi)的丙二醛隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，膜脂過氧化程度加重。各濃度24－表油菜素內(nèi)酯處理組的龍須菜丙二醛含量都低于對(duì)照，其中0.10 mg／L 24－表油菜素內(nèi)酯處理的龍須菜丙二醛含量最低，細(xì)胞膜酯過氧化程度最低，從而使藻體能維持正常的生理生化代謝過程。

紅藻中的光合色素除了葉綠素a外主要是藻膽蛋白，包括藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白。藻膽蛋白是PSⅡ捕光色素復(fù)合體，能夠直接吸收光能并傳遞給PSⅡ，但是卻容易受到高溫等外界環(huán)境的影響［22］，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在高溫逆境初期（1 d）龍須菜藻膽蛋白含量開始下降，這一結(jié)果應(yīng)證了高溫逆境對(duì)藻體內(nèi)藻膽蛋白的破壞。在實(shí)驗(yàn)整個(gè)過程中，各個(gè)24－表油菜素內(nèi)酯處理組的藻膽蛋白都高于對(duì)照組，其中0.1 mg／L處理組的藻膽蛋白顯著高于對(duì)照。藻紅蛋白熒光定量表達(dá)研究結(jié)果同樣顯示，處理組表達(dá)量高于對(duì)照組，尤其0.1 mg／L濃度處理組顯著高于對(duì)照組。24－表油菜素內(nèi)酯緩解了高溫對(duì)藻紅蛋白的破壞。

熱激蛋白的表達(dá)是細(xì)胞受高溫脅迫后在分子水平上最主要的響應(yīng)之一。熱激蛋白可以通過阻止蛋白質(zhì)的變性以及促使變性蛋白復(fù)性，保護(hù)脅迫條件下的細(xì)胞少受損傷。有研究表明在無芒雀麥中加入24－表油菜素內(nèi)酯能增加熱激蛋白基因表達(dá)從而提高抗熱力［23］。本實(shí)驗(yàn)顯示，24－表油菜素內(nèi)酯可顯著提高熱激脅迫下HSP70的表達(dá)水平，以提高在高溫下龍須菜的耐受性，尤其在0.1 mg／L濃度處理組有顯著性差異。

谷胱甘肽還原酶是植物細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)中重要的一員，它通過參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)而在細(xì)胞活性氧的清除中起重要作用［24］，郭麗紅等研究也表明谷胱甘肽還原酶在抗氧化系統(tǒng)和植物對(duì)逆境的適應(yīng)中起重要作用［25］。本實(shí)驗(yàn)研究顯示加入24－表油菜素內(nèi)酯處理組的GR相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組有所增加，以0.1 mg／L濃度處理組表達(dá)量最為顯著，從而提高龍須菜在高溫逆境時(shí)的抗氧化酶活性。

綜上所述24－表油菜素內(nèi)酯通過提高SOD、POD酶活性、HSP70、GR基因相對(duì)表達(dá)量，清除細(xì)胞在高溫逆境中增加的活性氧、變性蛋白，降低MDA含量，穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)；同時(shí)能提高體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)甘露醇含量，促進(jìn)藻膽蛋白的合成，促進(jìn)PSⅡ的光合作用活性從而使龍須菜在高溫下能維持正常的生理功能，提高高溫耐受力。

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