林勉，苗亮，李明云＊，俞寅寅，徐萬(wàn)土

（1.寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波315211；2.象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司，浙江 象山315702）

1 引言

真鯛Pagrosomusmaj or和黑鯛Spr ausmacrocephalus均是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。真鯛屬鱸形目、鯛科、真鯛屬，具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)好、色澤美、抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，但對(duì)鹽度、溫度敏感；黑鯛屬鱸形目、鯛科、黑鯛屬，對(duì)溫度、鹽度適應(yīng)范圍較廣，但養(yǎng)成周期長(zhǎng)、抗病能力弱［1］。二者各有優(yōu)缺點(diǎn)，通過(guò)雜交育種，有可能獲得具有雙親優(yōu)良性狀的雜交子代。目前已有鯛科魚(yú)類(lèi)雜交育種的研究報(bào)道，如江世貴等［2］進(jìn)行了平鯛（♀）與真鯛（♂）的雜交；單保黨等［3］對(duì)真鯛、黑鯛進(jìn)行了正、反交，均獲得了雜交子代；蔣宏雷等［4］、姜景騰等［5］的研究顯示由真鯛（♀）×黑鯛（♂）所得的雜交子代具有生長(zhǎng)速度快、適溫鹽廣、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)。雖然現(xiàn)有研究顯示真鯛（♀）×黑鯛（♂）的雜交子代呈現(xiàn)出明顯的雜交優(yōu)勢(shì)，但尚不清楚雜交子代的遺傳物質(zhì)構(gòu)成情況。筆者采用核型和AFLP分析，研究了真鯛、黑鯛及雜交子代的遺傳構(gòu)成。

核型和AFLP分析作為遺傳學(xué)研究的有效手段，被廣泛的應(yīng)用于海洋生物學(xué)的研究中，如雜交子代的染色體組成與雙親的差異分析［6］，群體遺傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)［7—8］、種質(zhì)鑒定［9］、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建［10—13］、基因定位［14］等。本研究不但能了解雜交育種后代的染色體組成、與雙親染色體組型的差異和雜種染色體的歸宿，而且能掌握親本和子代3個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)，互為補(bǔ)充更能揭示雜交子代雜種優(yōu)勢(shì)的遺傳情況，其結(jié)果可以為雜種優(yōu)勢(shì)研究和鯛科魚(yú)類(lèi)雜交育種實(shí)踐提供理論依據(jù)和參考資料。

2 材料與方法

2.1 材料

實(shí)驗(yàn)用真鯛、黑鯛、雜交子代各10尾，均取自浙江象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司，真鯛平均體質(zhì)量29.5 g、體長(zhǎng)12.9 cm，黑鯛平均體質(zhì)量24.9 g、體長(zhǎng)11.8 m，雜交子代平均體質(zhì)量30.5 g，體長(zhǎng)11.8 cm。

AFLP試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PHA、秋水仙素購(gòu)自Sigma公司；甲醇、乙酸、硝酸銀等均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自寶生物工程 （大連）有限公司。

2.2 染色體標(biāo)本制備與核型分析

以體細(xì)胞體內(nèi)培養(yǎng)法制備真鯛、黑鯛及雜交子代的染色體標(biāo)本，具體為：按10μg／g魚(yú)體質(zhì)量劑量體腔注射PHA，16～36 h后再按3μg／g魚(yú)體質(zhì)量劑量體腔注射秋水仙素溶液，4 h后取頭腎，以常規(guī)空氣干燥法制備染色體玻片標(biāo)本，經(jīng)0.037 5 mol／L的氯化鉀溶液低滲處理和固定液（甲醇：乙酸＝3∶1）固定，Giemsa液染色后鏡檢。

對(duì)真鯛、黑鯛及雜交子代的染色體標(biāo)本分別取100個(gè)染色體分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，并選出10個(gè)清晰的中期分裂相進(jìn)行顯微照相、放大和測(cè)量。按Levan等［15］的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)染色體進(jìn)行分類(lèi)；按Corman［16］的方法統(tǒng)計(jì)臂數(shù)，即中部和亞中部著絲粒染色體的臂數(shù)計(jì)為2，亞端部和端部著絲粒計(jì)為1。

2.3 AFLP擴(kuò)增與分析

以常規(guī)酚／氯仿／異戊醇法提取真鯛、黑鯛、雜交子代的基因組DNA。參照王志勇等［17］的方法進(jìn)行AFLP擴(kuò)增。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出能在3種魚(yú)種擴(kuò)增到清晰條帶的2對(duì)AFLP選擴(kuò)引物組合（E－AAC／M－CCT和E－ACA／M－CGA）進(jìn)行擴(kuò)增分析，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離條帶，硝酸銀染色后凝聚成像。參照嚴(yán)駿驄等［18］和王曉清等［19］的方法進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。有關(guān)計(jì)算公式參照如下：

式中，Nij為個(gè)體i與j共有的片段數(shù)量，Ni、Nj分別為個(gè)體i與j各自具有的片段數(shù)量；

式中，S為相似系數(shù)。

表1 AFLP選擴(kuò)引物序列Tab.1 Sequence of AFLP selective amplification pri mer

3 結(jié)果

3.1 真鯛、黑鯛及其雜交子代的染色體核型

中期染色體觀察計(jì)數(shù)結(jié)果顯示真鯛、黑鯛和雜交子代中染色體數(shù)為48的分裂相分別占總數(shù)的68%、77%和60%（表2），因此確定三者的染色體眾數(shù)均為48。

表2 不同染色體數(shù)目的分裂相個(gè)數(shù)占全部分裂相個(gè)數(shù)的百分比Tab.2 The percentage of different number of chromosomes split phase number

真鯛、黑鯛和雜交子代的染色體中期分裂相見(jiàn)圖1。真鯛染色體核型為2n＝2st＋46t，NF＝48（見(jiàn)圖1a）；黑鯛染色體核型為2n＝4 m＋4sm＋2st＋38t，NF＝56（見(jiàn)圖1b）；雜交子代染色體核型為2n＝30 m＋8sm＋2st＋8t＝48，NF＝86（見(jiàn)圖1c）。真鯛的染色體只有st和t兩種類(lèi)型；黑鯛的染色體有st、t、sm和m 4種類(lèi)型。雜交子代雖然染色體類(lèi)型與黑鯛相同，但各類(lèi)型染色體數(shù)目與黑鯛不同：黑鯛染色體以t型居多，而雜交子代則是m型居多。

3.2 真鯛、黑鯛及其雜交子代的AFLP分析

兩對(duì)AFLP選擇性擴(kuò)增引物組合（E－AAC／M－CCT和E－ACA／M－CGA）對(duì)真鯛、黑鯛及雜交子代的擴(kuò)增結(jié)果顯示，共檢出擴(kuò)增條帶278個(gè)；真鯛特有條帶108條，有67條出現(xiàn)在雜交子代中；黑鯛特有條帶93條，有21條出現(xiàn)在雜交子代中；雜交子代中出現(xiàn)了15條非親條帶（表3）。

圖1 中期分裂相染色體及核型Fig.1 The metaphase chromosome and karyotype

表3 AFLP擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)Tab.3 Numbers of amplified bands with 2 AFLP selective primer pairs

AFLP條帶計(jì)算出雜交子代與真鯛、黑鯛的相似系數(shù)分別為0.350和0.113，雜交子代個(gè)體間的相似系數(shù)為0.709；雜交子代與真鯛、黑鯛的遺傳距離分別為1.050和2.180，雜交子代個(gè)體間的遺傳距離為0.344。結(jié)果顯示雜交子代與母本種（真鯛）的遺傳相似度更高、遺傳距離更近。

4 討論

在雜交育種中，雜交子代由于具有雙親的遺傳物質(zhì)而同時(shí)具有父本種和母本種的一些性狀，并且雜交子代還可能因雙親的遺傳物質(zhì)的重組而出現(xiàn)一些異于雙親的性狀。如黃帆［20］對(duì)高加索三葉草與白三葉雜交后代的遺傳特性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示雜種F1代是雙親真實(shí)的雜交后代，其抗旱能力和生育期均介于兩者中間。周麗清等［21—22］對(duì)櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的正反交子代進(jìn)行了核型分析，結(jié)果顯示正反交子代均為偏向母本類(lèi)型的異源二倍體，雜交子代顯著提高了櫛孔扇貝的生產(chǎn)性能尤其是抗逆能力。核型分析顯示真鯛、黑鯛、及其雜交子代的染色體數(shù)目均為48條，但具體到染色體類(lèi)型及各類(lèi)型染色體數(shù)目，雜交子代與其父本種和母本種均存在較大差異：雜交子代有15對(duì)中部著絲粒染色體，4對(duì)亞中部著絲粒染色體，4對(duì)端部著絲粒染色體和1對(duì)亞端部著絲粒染色體，其父本種（黑鯛）雖然也是有這4種類(lèi)型的染色體，但數(shù)目分別為2對(duì)、2對(duì)、1對(duì)和19對(duì)，而母本種（真鯛）則僅有端部（23對(duì)）和亞端部（1對(duì)）著絲粒染色體。表明真鯛和黑鯛的遺傳物質(zhì)在雜交過(guò)程中發(fā)生了較大的重組。

AFLP結(jié)果顯示108條真鯛特有條帶中有67條出現(xiàn)在雜交子代中，93條黑鯛特有條帶中有21條出現(xiàn)在雜交子代中，說(shuō)明子代是同時(shí)含有父、母本遺傳物質(zhì)的真正的雜交種。遺傳相似系數(shù)和遺傳距離分析表明，雜交子代與母本種（真鯛）的遺傳相似度更高、遺傳距離更近，說(shuō)明雜交子代與母本之間具有遺傳同質(zhì)性，而與父本的遺傳差異則較大。隋班良等［23］對(duì)黃姑魚(yú)（♀）與大黃魚(yú)（♂）雜交子代的AFLP分析結(jié)果也顯示雜交子代在遺傳上偏向母本。另外，在雜交子代中還出現(xiàn)了15條非親條帶，這與核型分析結(jié)果相互印證，表明父、母本遺傳物質(zhì)在雜交子代中發(fā)生了重組。萬(wàn)俊芬等［24］對(duì)櫛孔扇貝和華貴櫛孔扇貝雜交的ISSR檢測(cè)顯示子代中非親位點(diǎn)的出現(xiàn)比例為16.7%～18.7%；何斌等［25］發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝和蝦夷扇貝正反雜交子代中分別有12.9% 和14.3%ISSR位點(diǎn)為非親位點(diǎn)。非親位點(diǎn)可能來(lái)源于不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段之間形成的異源雙鏈［26］，或者由于配子形成過(guò)程中染色體的不等價(jià)交換產(chǎn)生的新序列［27］。遺傳物質(zhì)的重組可能會(huì)產(chǎn)生新的性狀，蔣宏雷等［4］、姜景騰等［5，28］的研究結(jié)果均顯示，與父母本相比，其雜交子代表現(xiàn)出明顯的雜交優(yōu)勢(shì)，并具有部分異于雙親的新性狀，如耐低氧能力，這可能與雙親遺傳物質(zhì)在子代中發(fā)生了重組有關(guān)。另外，研究結(jié)果顯示雜交子代個(gè)體間的遺傳相似系數(shù)為0.709、遺傳距離為0.344，這可能與父、母本遺傳物質(zhì)在不同個(gè)體中的重組率不同有關(guān)。

通過(guò)染色體核型分析和AFLP擴(kuò)增分析，證明了真鯛（♀）×黑鯛（♂）的雜交子代是同時(shí)具有父本和母本遺傳物質(zhì)的異源二倍體，并且父、母本遺傳物質(zhì)在雜交中發(fā)生了一定程度的重組，使雜交子代表現(xiàn)出一定的雜交優(yōu)勢(shì)，但這些優(yōu)良性狀能否穩(wěn)定遺傳還需要做進(jìn)一步的追蹤研究。本研究為今后更加深入地研究雜交子代的生長(zhǎng)、抗逆、抗病等特性提供了理論基礎(chǔ)，也為探討雜交優(yōu)勢(shì)的遺傳機(jī)制提供了參考資料。

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