高瑞娟，尚伯楊，盛唯瑾，趙春燕，李電東，甄永蘇

?

抗明膠酶單鏈抗體與力達霉素融合蛋白抗腫瘤作用機制及療效研究

高瑞娟，尚伯楊，盛唯瑾，趙春燕，李電東，甄永蘇

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室

探討抗明膠酶單鏈抗體 Fv 與力達霉素（LDM）融合蛋白的抗腫瘤作用機制及療效。

采用三聯(lián)徑向加壓 C4柱制備 LDM 發(fā)色團 AE，體外分子重建將其裝入融合蛋白Fv-LDP 中，Superdex 75 層析獲得 Fv-LDP-AE。反相 HPLC 測定純度或相對含量。流式細胞術(shù)測定 DNA 含量；采用 SA-β-gal 染色、Western blot 和細胞傷口愈合實驗分別檢測藥物對細胞衰老、蛋白表達和遷移的影響；通過動物模型評價藥物療效。

Fv-LDP-AE 承襲了 LDM 誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯、凋亡和裂亡的作用特點，并顯示出更強的誘導(dǎo)衰老和抗遷移作用。Fv-LDP-AE 誘導(dǎo)凋亡和抑制遷移依次與 caspases 通路激活和 MMP-2 降調(diào)節(jié)有關(guān)。Fv-LDP-AE 可抑制小鼠和裸鼠移植瘤生長，抑制率分別可達到 86.6% 和 82.5%。

Fv-LDP-AE 對小鼠和裸鼠移植瘤有效，可能與其對細胞周期阻滯、凋亡、裂亡和衰老的誘導(dǎo)以及遷移的抑制有關(guān)。

明膠酶類； 單鏈抗體； 腫瘤微環(huán)境； 力達霉素

明膠酶（gelatinases，Gel）是在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族重要成員，包括 MMP-2（Gel-A）和 MMP-9（Gel-B）兩種組分[1]。明膠酶在大多數(shù)腫瘤細胞高表達，其亦可分泌到腫瘤細胞外，誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），使它們產(chǎn)生更多的明膠酶[2-3]?？墒牵髂z酶在正常細胞中卻表達極低甚或檢測不到，因而是臨床上判斷腫瘤惡性程度、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標[4-5]。在功能上，明膠酶能夠降解基底膜和細胞外基質(zhì)中的IV型膠原等多種成分，促進腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。抑制明膠酶活性可抑制腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。因此，明膠酶已成為抗癌藥物研究的重要分子靶點[8]。

力達霉素（lidamycin，LDM），又名 C-1027，是一種九元環(huán)烯二炔抗腫瘤抗生素。LDM具有高效抗腫瘤活性，其體外細胞毒性比絲裂霉素和阿霉素強 10000 倍；在體內(nèi)，LDM 對小鼠和裸鼠移植瘤亦具有顯著療效[9-11]。LDM 結(jié)構(gòu)獨特，由一個烯二炔發(fā)色團 AE（843 D）和一個酸性輔基蛋白 LDP（10500 D）以非共價鍵結(jié)合而成[12]。AE 嵌入雙螺旋 DNA 分子小溝時，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生誘變，所形成的苯環(huán)型雙自由基中間體能夠奪取核苷酸核糖骨架 C4'、C1' 和 C5' 位的氫原子，導(dǎo)致 DNA 單鏈和（或）雙鏈斷裂[13]。AE 本身極不穩(wěn)定，LDP 對 AE 活性起保護作用。AE 和 LDP 在體外可被拆分和重建，重建 LDM 與天然 LDM 活性相同[14]。因此，LDM 是比較理想的高效“彈頭”分子。

融合蛋白 Fv-LDP-AE 是作者實驗室以明膠酶為靶點，以抗明膠酶單鏈抗體 scFv（3G11）為運載體，以 LDM 為高效“彈頭”，先通過 DNA 重組構(gòu)建并表達融合蛋白 Fv-LDP，然后再通過體外分子重建技術(shù)將 LDM 游離 AE 裝配其中而制備的一種抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移小型化抗體藥物。其設(shè)計理念是通過藥物對明膠酶的特異靶向作用，將高效“彈頭”LDM 富集至明膠酶高表達腫瘤及其微環(huán)境細胞，主要依靠 LDM 殺傷作用來治療腫瘤。先前，作者已建立重組菌中 Fv-LDP 含量測定新方法，優(yōu)化了該重組菌高效表達所需的最佳培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件，實現(xiàn)了高密度發(fā)酵，并完成了 Fv-LDP 制備過程優(yōu)化[15-18]。本文將在前述研究基礎(chǔ)上，分離 LDM 游離發(fā)色團 AE，并通過體外分子重建技術(shù)制備融合蛋白 Fv-LDP-AE，進而深入探討其抗腫瘤作用機制及療效。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試藥 LDM 由本所金蓮舫老師提供；融合蛋白 Fv-LDP 參照文獻[18]自制。

1.1.2 色譜柱 HiLoad? Superdex 75 預(yù)裝柱（600 mm × 16 mm）購自美國 GE 公司；三聯(lián)徑向加壓 Delta-PAK C4柱（30 nm，100 mm × 25 mm）購自美國 Waters 公司；Vydac C4分析柱（5 μm，150 mm × 4.6 mm）購自美國 Grace 公司。

1.1.3 細胞株 明膠酶高表達的人肝癌 BEL-7402 和人巨細胞肺癌 PG-BE1 細胞分別購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院和北京協(xié)和細胞資源中心[19]，而表達明膠酶的小鼠肝癌22（H22）細胞由本室保存并經(jīng)昆明小鼠腹水傳代培養(yǎng)[20]。

1.1.4 實驗動物 18 ~ 20 g 雌性昆明小鼠和 BALB/c 裸鼠分別購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[動物許可證號：SCXK（軍）2012-0004]和北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SCXK（京）2012-0001]，均飼養(yǎng)在標準的明暗各半的環(huán)境中，20 ~ 22 ℃，相對濕度 50% ~ 60%[設(shè)施許可證號：SYXK（京）2012-0021]。所有受試動物均可自由進水和攝食。所有實驗均按照國際公認的實驗動物照料和使用原則進行。

1.1.5 主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)液和胎牛血清分別購自美國 Hyclone 和 Gibco 公司；預(yù)染蛋白 marker 和 BCA 試劑盒購自美國 Pierce 公司；所有兔抗 anti-cleaved PARP、anti-caspase-3、anti-cleaved caspase-3、anti-caspase-9、anti-cleaved caspase-9、anti-MMP-2、anti-MMP-9、anti-β-actin 和辣根過氧化物酶 HRP 標記羊抗兔 IgG 購自美國 CST 公司；乙腈和三氟乙酸購自德國 Merck 公司；戊二醛購自美國 Sigma 公司；RNase A、PI 和 X-gal 購自美國 Amresco 公司；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 LDM 游離 AE 制備 將 100 mg LDM 粉劑溶于 1 ml 水中，采用三聯(lián)徑向加壓Delta-PAK C4柱對其進行層析分離以制備游離 AE。制備條件為：流動相為含 22% 乙腈的 0.0125% 三氟乙酸溶液，檢測波長為 350 nm，流速為 4 ml/min。采用 Vydac C4分析柱，通過反相 HPLC 分析分段收集的 AE 樣品，并將活性 AE 濃度較高者合并。反相 HPLC 分析時，流動相和檢測波長同“游離 AE 制備條件”，流速為 0.6 ml/min。

1.2.2 Fv-LDP-AE 制備及熱穩(wěn)定性分析 將LDM游離 AE 按分子比 5:1 輕柔加入Fv-LDP/PBS 溶液中（體積比為 1:50），4 ℃，50 ×振搖 16 h。超濾濃縮混合物，Superdex 75 預(yù)裝柱層析以去除未偶聯(lián)游離 AE。Fv-LDP-AE 鑒定使用 Vydac C4分析柱采用反相 HPLC 進行，條件同步驟“1.2.1”。熱穩(wěn)定性檢測時，等量分裝 Fv-LDP-AE 樣品于 1.5 ml 離心管，置于 37 ℃水浴中，并于特定時間點取出，使用 Vydac C4分析柱并用上述流動相和流速進行反相 HPLC 分析，檢測波長為 280 nm 和 350 nm。

1.2.3 流式細胞術(shù) Fv-LDP-AE 處理細胞 4 h，PBS（pH 7.4）洗 3 次，換入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 72 h。收集懸浮和貼壁細胞，110 ×離心 5 min，棄上清；預(yù)冷 PBS 洗 2 次，預(yù)冷 70% 乙醇 –20 ℃固定過夜。上機檢測前，110 ×離心 10 min，棄乙醇，預(yù)冷 PBS 洗 2 次，加入 RNase A 至終濃度 50 μg/ml，37 ℃消化 30 min，加入終濃度65 μg/ml 的 PI，避光染色 1 h。400 目尼龍網(wǎng)過濾細胞，流式細胞儀測定 DNA 含量。

1.2.4 衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶染色 對數(shù)期細胞消化計數(shù)，按 4 × 104個/孔接種于 24 孔板內(nèi)。次日，加入不同濃度藥物處理 4 h，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，0.5 % 戊二醛室溫固定 10 min，PBS（pH 7.4）洗 3 次，2 mmol/L MgCl2洗 1 次，衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色液[1 mg/mlX-gal、5 mmol/L K3Fe(CN)6、5 mmol/L K4Fe(CN)6、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、40 mmol/L 檸檬酸/Na2HPO4，pH 6.0]于 37 ℃染色 16 ~ 20 h，倒置顯微鏡下計數(shù) β-半乳糖苷酶染色陽性細胞，細胞總數(shù)為 300 個，結(jié)果以陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比表示。

1.2.5 Western blot Fv-LDP-AE 處理細胞 4 h，PBS（pH 7.4）洗 3 次后加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 72 h。懸浮細胞收集后用細胞裂解液直接裂解；貼壁細胞用預(yù)冷 PBS 洗 3 次，加入細胞裂解液裂解后用細胞刮刀刮下，與裂解的懸浮細胞合并收集到 1.5 ml Eppendorf 管中，冰上繼續(xù)裂解 30 min，4 ℃、20 000 ×離心 10 min，BCA 試劑盒測定上清蛋白濃度。SDS-PAGE 分離等量上清蛋白，半干電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，含 5% 脫脂奶粉的 TBST（20 mmol/L Tris base、150 mmol/L NaCl、0.05% Tween-20，pH7.5）室溫封閉至少 1 h，加入 1:1000 稀釋的一級抗體于 4 ℃孵育過夜；TBST洗3 次，用 1:2000 稀釋的 HRP 標記羊抗兔 IgG 于室溫孵育 2 h；TBST 洗 3 次，化學(xué)發(fā)光液顯色，拍照。

1.2.6 細胞傷口愈合實驗 采用細胞傷口愈合實驗研究 LDM 和 Fv-LDP-AE 對人肝癌BEL-7402 細胞遷移的影響[21]。對數(shù)生長期細胞接種于 6 孔板中，次日用 20 μl 無菌吸頭在板中劃線。37 ℃預(yù)溫 PBS 洗 3 次，加入不同濃度 LDM 或 Fv-LDP- AE 處理 24 h，光學(xué)顯微鏡觀察，拍照。藥物處理后細胞內(nèi)明膠酶表達水平通過 Western blot 方法進行檢測和均一化比較。

1.2.7 動物模型 取小鼠 H22 腹水，以生理鹽水稀釋成細胞數(shù)為 1.5′106個/0.2 ml 接種于昆明小鼠右側(cè)腋窩皮下（第 0 天）。次日，荷瘤小鼠被隨機分成 5 組，每組 10 只。在第 1 天和第 7 天，分別靜脈給予 0.4、0.6 和 0.8 mg/kg Fv-LDP-AE，以 0.05 mg/kg LDM 作為對照藥物同步給予，無藥對照組以生理鹽水進行注射。實驗第 11 天處死動物，剝離腫瘤并測瘤重，計算抑制率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

兩組之間比較采用 Student’s檢驗，< 0.05 代表差異顯著，< 0.01 表示差異高度顯著。

2 結(jié)果

2.1 Fv-LDP-AE 制備及其熱穩(wěn)定性

LDM 可被拆分成 LDP 和 AE，在監(jiān)測記錄紙上顯示為 5 個峰（圖 1A），將其中的活性 AE 峰（P4）單獨收集，反相 HPLC 分析其保留時間為 7.952 min，純度為 95% 以上（圖 1B）。通過體外分子重組技術(shù)，LDM 游離 AE 可被整合入 Fv-LDP 中，形成融合蛋白 Fv-LDP-AE。反相 HPLC 結(jié)果顯示，F(xiàn)v-LDP-AE 呈現(xiàn)保留時間分別為 2.966、7.789 和 8.980 min 的 3 個色譜峰，依次為 Fv-LDP、活性 AE 以及芳構(gòu)化 AE（圖 2A）。Fv-LDP-AE 熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)v-LDP 部分在前 2 h 內(nèi)降解迅速，之后會相對穩(wěn)定，在 48 h 時仍有 36.8% 的樣品以完整 Fv-LDP 存在；AE 部分相對不穩(wěn)定，其含量隨溫育時間延長逐漸減少，在 48 h 時，僅有 19.3% 的 AE 以活性形式存在（圖 2B）。

2.2 Fv-LDP-AE 承襲了 LDM 對人腫瘤細胞周期阻滯、凋亡和裂亡的誘導(dǎo)作用

圖 3 結(jié)果顯示，0.01 nmol/L Fv-LDP-AE 可使 BEL-7402 和 PG-BE1 細胞周期阻滯于S 期和G2 + M 期，更大濃度時則使 PG-BE1 細胞阻滯于G2 + M 期；Fv-LDP-AE 可誘導(dǎo) BEL-7402 和 PG-BE1 細胞同時發(fā)生凋亡和裂亡，細胞死亡比例呈劑量依賴性增加。對照藥 LDM 亦可誘導(dǎo)這兩種細胞產(chǎn)生類似的周期阻滯與細胞死亡效果。Western blot 進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v-LDP-AE 和 LDM 均能夠激活人 BEL-7402 細胞中的凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3 和 caspase-9 表達，產(chǎn)生 PARP 切割帶（圖 4）。這些結(jié)果提示，F(xiàn)v-LDP-AE 承襲了 LDM 誘導(dǎo)人腫瘤細胞周期阻滯、凋亡和裂亡的作用特點，F(xiàn)v-LDP-AE 和 LDM 誘導(dǎo)人 BEL-7402 細胞凋亡與 caspase-3 和 caspase-9 激活有關(guān)。

OD3500.020 0.015 0.010 0.005 0 2 4 6 8 10 A 時間（min）Time (min)B

Figure 1 Separation (A) and reverse-phase HPLC analysis (B) of free AE from LDM

OD3500.012 0.008 0.004 0 AE 或 Fv-LDP 相對含量（%）AE or Fv-LDP (% of control)100 80 60 40 20 0 2 4 6 8 10 12 6 12 18 24 30 36 42 48 時間（h）Time (h)A 時間（h）Time (h)B

Figure 2 Identification (A) and thermostability (B) of Fv-LDP-AE analyzed by reverse-phase HPLC

對照 Control 0.01 nmol/L LDM 0.5 nmol/L LDM BEL-7402 細胞數(shù)No. of BEL-7402 cells 對照 Control 0.01 nmol/L Fv-LDP-AE 0.5 nmol/L Fv-LDP-AE BEL-7402 細胞數(shù)No. of BEL-7402 cells DNA 含量DNA content A 對照 Control 0.01 nmol/L LDM 0.1 nmol/L LDM PG 細胞數(shù)No. of PG cells 對照 Control 0.01 nmol/L Fv-LDP-AE 0.1 nmol/L Fv-LDP-AE PG 細胞數(shù)No. of PG cells DNA 含量DNA content B

Figure 3 Cell cycle arrest, apoptosis and mitotic cell death analyzed by flow cytometry in human hepatoma BEL-7402 (A) and PG-BE1 (B) cells treated with LDM and Fv-LDP-AE, respectively

2.3 Fv-LDP-AE 比 LDM 5177有更強的誘腫瘤細胞衰老作用

為了研究LDM 和Fv-LDP-AE 對衰老樣表型的影響，我們檢測了 BEL-7402 和PG-BE1 細胞中 SA-β-gal 表達情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)v-LDP-AE 呈劑量依賴性誘導(dǎo) BEL-7402 和 PG-BE1 細胞衰老，其中 0.1 nmol/L Fv-LDP-AE 可使 BEL-7402 和 PG-BE1 細胞 SA-β-gal 表達陽性率分別比無藥對照組提高 3 倍和 6.4 倍，比等摩爾 LDM 組分別提高 18.6% 和 12.3%，提示 Fv-LDP-AE 誘導(dǎo)腫瘤細胞衰老活性強于對照藥 LDM（圖 5）。

2.4 Fv-LDP-AE 較強的細胞遷移抑制作用與 MMP-2 蛋白降調(diào)節(jié)有關(guān)

如圖 6A 所示，劃痕產(chǎn)生 24 h 后，劃痕邊緣的 BEL-7402 細胞會很快向遷移區(qū)域移動；Fv-LDP-AE 可抑制 BEL-7402 細胞的這種快速遷移，并導(dǎo)致部分細胞死亡，漂浮于培養(yǎng)液中；LDM 對細胞遷移的抑制作用略弱于 Fv-LDP-AE。為揭示 Fv-LDP-AE 抗遷移作用強于 LDM 是否與明膠酶表達水平有關(guān)，本研究采用 Western blot 方法比較了LDM 和Fv-LDP-AE 作用 24 h 后BEL-7402 細胞內(nèi)明膠酶表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v-LDP-AE 可呈劑量依賴性降調(diào)節(jié) BEL-7402 細胞內(nèi) MMP-2 蛋白表達，而 LDM 不能抑制該蛋白表達；此外，F(xiàn)v-LDP-AE 對 MMP-9 的升調(diào)節(jié)作用弱于等摩爾 LDM（圖 6B 和圖 6C）。這些結(jié)果提示，F(xiàn)v-LDP-AE 細胞遷移抑制作用好于對照藥 LDM 與 MMP-2蛋白降調(diào)節(jié)有關(guān)。

Caspase-3 Cleaved caspase-3 Caspase-9 Cleaved caspase-9 Cleaved PARP β-actin 0 0.01 0.05 0.1 0.5 0 0.01 0.05 0.1 0.5 LDM（nmol/L） Fv-LDP-AE（nmol/L）

Figure 4 Effect of LDM and Fv-LDP-AE on the expression of apoptosis-related proteins in human hepatoma BEL-7402 cells analyzed by Western blot

SA-β-gal 陽性率（%）SA-β-gal positive rate (%)100 80 60 40 20 0 SA-β-gal 陽性率（%）SA-β-gal positive rate (%)100 80 60 40 20 0 0 0.01 0.1 0 0.01 0.1 藥物濃度（nmol/L）Drug concentration (nmol/L)A 藥物濃度（nmol/L）Drug concentration (nmol/L)B

Figure 5 Cellular senescence induced by LDM and Fv-LDP-AE in human hepatoma BEL-7402 (A) and lung cancer PG-BE1 (B) cells

對照 Control0.1 nmol/L1 nmol/L LDM Fv-LDP-AEA

MMP-2 MMP-9 β-actin 0 0.1 0.5 0 0.1 0.5 LDM（nmol/L） Fv-LDP-AE（nmol/L）B

MMP-2/β-actin1.8 1.2 0.6 0 MMP-9/β-actin2.4 1.6 0.8 0 0 0.1 1 0 0.1 1 藥物濃度（nmol/L）Drug concentration (nmol/L) 藥物濃度（nmol/L）Drug concentration (nmol/L)C

與無藥對照組比，*<0.01，#< 0.05；與等摩爾 LDM 組比，a< 0.01，b< 0.05。

*< 0.01 and#<0.05 compared with drug-free control;a<0.01 andb<0.05 compared with equimolar LDM group.

圖 6 LDM 和 Fv-LDP-AE 對人肝癌 BEL-7402 細胞遷移和明膠酶表達的影響（A：細胞遷移；B：明膠酶表達；C：明膠酶表達的均一化比較）

Figure 6 Effect of LDM and Fv-LDP-AE on cell migration and gelatinases expression in human hepatoma BEL-7402 cells (A: Cell migration; B: Gelatinases expression; C: Normalized comparison of gelatinases expression)

2.5 Fv-LDP-AE 顯著抑制小鼠和裸鼠移植瘤生長

本研究首先觀察了 Fv-LDP-AE 對小鼠 H22 移植瘤生長的影響。如表 1 所示，F(xiàn)v-LDP-AE 呈劑量依賴性抑制小鼠 H22 移植瘤生長，其中，0.8 mg/kg Fv-LDP-AE 對 H22 荷瘤小鼠的治療效果最好，抑制率為 86.6%，顯著強于耐受劑量的 LDM（69.6%）。在整個實驗期間，所有受試小鼠體重均呈遞增趨勢，未見副作用。

為進一步評價 Fv-LDP-AE 對人移植瘤的治療效果，本研究還建立了人肝癌 BEL-7402 裸鼠模型。圖 7A 結(jié)果顯示，F(xiàn)v-LDP-AE 能夠抑制人肝癌 BEL-7402 裸鼠移植瘤生長，并表現(xiàn)出比 0.05 mg/kg 耐受劑量 LDM 更強的腫瘤生長抑制作用；在實驗第 27 天，F(xiàn)v-LDP-AE 抑瘤率為 82.5%，而耐受劑量的 LDM 抑瘤率僅為 65.6%，兩者相比差異顯著（< 0.05）。在整個實驗治療期間，LDM 處理組動物平均體重下降 14.0%，而Fv-LDP-AE 處理組僅下降 9.8%，荷瘤裸鼠進食和活動均未見明顯異常（圖 7B）。

表 1 Fv-LDP-AE 抑制昆明小鼠 H22 移植瘤生長

注：與對照組比，*< 0.01；與 LDM 組比，a< 0.01，b< 0.05。

Notes:*< 0.01 compared with control;a< 0.01 andb< 0.05 compared with LDM group.

腫瘤體積（mm3）Tumor volume (mm3)800 600 400 200 0 體重（g）Body weight (g)28 24 20 16 12 8 4 0 6 9 13 16 20 23 27 6 9 13 16 20 23 27 腫瘤接種時間（d）Time after tumor inoculation (d)A 腫瘤接種時間（d）Time after tumor inoculation (d)B

Figure 7 Efficacy of Fv-LDP-AE on human hepatoma BEL-7402 xenograft in athymic mice (A: Curves of tumor growth; B: Curves of body weight change)

3 討論

近年來，腫瘤微環(huán)境因?qū)Π┘毎L和擴散的重要作用而成為新的癌癥治療靶點[22]。靶向癌細胞并同時靶向腫瘤微環(huán)境是現(xiàn)代癌癥治療新理念。明膠酶高表達于腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境細胞，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要作用，因此，抑制明膠酶活性就可抑制腫瘤細胞及腫瘤微環(huán)境細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[1-3,7]。Fv-LDP-AE 是作者實驗室以明膠酶為靶點，以烯二炔抗腫瘤抗生素 LDM 為高效彈頭，通過 DNA 重組和體外分子重建特色技術(shù)構(gòu)建的一種基于 scFv 的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移小型化抗體融合蛋白[23]。Fv-LDP-AE 既能夠靶向腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境細胞，又具有將彈頭分子 LDM 攜帶至靶部位以發(fā)揮其強效抗腫瘤作用的功能，體現(xiàn)了現(xiàn)代癌癥治療新理念，發(fā)展前景光明。

烯二炔抗腫瘤抗生素 LDM 可在體外拆分為輔基蛋白 LDP 和發(fā)色團 AE[14]，在監(jiān)測記錄紙上顯示為5 個分離峰。LDP 對活性 AE 起保護作用，亦可作為支架定向構(gòu)建其他新型抗腫瘤抗體藥物。例如，作者實驗室曾用 LDP 作支架，以 AE 為高效彈頭，構(gòu)建了針對 EGFR 靶點的基于scFv 的小型化抗體藥物ER(Fv-LDP-AE) 和 ER(Fv)- LDP-NGR-AE，深入研究發(fā)現(xiàn)它們對人類癌細胞具有更強活性和選擇性，提示 AE 再裝配能夠提高融合蛋白ER(Fv-LDP) 和ER(Fv)-LDP-NGR 的抗腫瘤作用，且優(yōu)于單藥 LDM[24-25]。與ER(Fv-LDP-AE) 類似，LDM 游離 AE 也可被成功裝配入以 LDP 為支架的抗明膠酶單鏈抗體融合蛋白 Fv-LDP 中以形成新型抗體藥物 Fv-LDP-AE，且已初步證明 Fv-LDP-AE 在抑制腫瘤細胞增殖和侵襲方面比 LDM 更有優(yōu)勢[23]。上述結(jié)果提示，以 LDP 為支架，以 AE 為高效彈頭，針對腫瘤不同靶點可研發(fā)出不同的基于 scFv 的新型抗體藥物，以建立基于 LDM 和 scFv 的小型化抗體藥物新平臺。

據(jù)報道，LDM 作用機制新穎多樣，可誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯、裂亡、凋亡和衰老，還能抑制腫瘤細胞侵襲和遷移[26-29]。在前期研究中，作者曾通過 Hoechst33342 和 PI 染色以及 DNA ladder 方法發(fā)現(xiàn)了 Fv-LDP-AE 能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞形成多個微核，并產(chǎn)生凋亡 DNA 梯帶[23]。本研究采用流式細胞術(shù)方法在揭示 Fv-LDP-AE 具有周期阻滯作用的同時，亦再次證明了 Fv-LDP-AE 誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡和裂亡的發(fā)生，并用 Western blot 方法進一步揭示了 Fv-LDP-AE 誘導(dǎo)細胞凋亡與 caspases 通路激活有關(guān)。值得注意的是，作為 Fv- LDP-AE 彈頭分子的 LDM 部分也可能通過調(diào)節(jié)其他分子如 p38MAPK、JNK 等參與細胞凋亡的發(fā)生[27]。

另外，本研究還新發(fā)現(xiàn)，除具有誘導(dǎo)腫瘤細胞衰老的作用外，F(xiàn)v-LDP-AE 還具有抑制腫瘤細胞遷移的功能，且抗遷移效果好于單用 LDM，其原因可能有：①Fv-LDP-AE 的靶點是在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用的明膠酶，其對明膠酶高表達腫瘤細胞的特異免疫反應(yīng)使得 Fv-LDP-AE 更易富集至腫瘤細胞而發(fā)揮生物學(xué)作用[23]；②Fv- LDP-AE 能夠抑制腫瘤細胞明膠酶分泌，且抗明膠酶分泌作用稍好于等摩爾 LDM[23]；③Fv-LDP-AE 能夠顯著降調(diào)節(jié) MMP-2 蛋白表達，并部分遏制 LDM 作用引發(fā)的 MMP-9 蛋白表達水平的升高。

此外，F(xiàn)v-LDP-AE 良好的體外抗腫瘤作用亦在荷瘤鼠模型內(nèi)得到了驗證。在建立的小鼠 H22 移植瘤模型中，0.4 mg/kg Fv-LDP-AE 可使腫瘤抑制率達到 83.0%，與耐受劑量的 LDM（69.6%）相比差異顯著，而等劑量 Fv-LDP-AE 對裸鼠人肝癌 BEL-7402 移植瘤的治療亦取得了類似結(jié)果，提示通過抗明膠酶單鏈抗體與 LDM 偶聯(lián)制備融合蛋白 Fv-LDP-AE 可進一步提高 LDM 抗腫瘤療效。

當前，抗體藥物研發(fā)已成為全球的朝陽產(chǎn)業(yè)，小型化和高效化是其兩大發(fā)展趨勢。小型化抗體不需要糖基化修飾，可在原核中表達，操作方便，生產(chǎn)成本低；而且，小型化抗體刪除了 Fc 段，分子質(zhì)量變小，免疫原性大大降低，實體瘤穿透性亦比完整抗體高?？贵w藥物高效化主要是將高效彈頭藥物與抗體偶聯(lián)制成化學(xué)偶聯(lián)物或通過基因工程手段制成融合蛋白，從而提高抗體藥物對腫瘤細胞的作用強度，降低藥物用量。因此，通過小型化和高效化手段產(chǎn)生的抗體藥物在降低免疫原性，提高實體瘤穿透性，增強抗腫瘤活性以及降低成本等方面均具有很大優(yōu)勢，容易獲得更好效果。本研究 Fv-LDP-AE 由抗明膠酶單鏈抗體 scFv(3G11) 和彈頭分子 LDM 共同構(gòu)成，分子量為 39.6 kD，約為完整抗體3G11（150 kD）的 1/4，因此，F(xiàn)v-LDP- AE 的研制完全符合抗體藥物小型化和高效化的發(fā)展趨勢，研發(fā)前景光明。本研究對 Fv-LDP-AE 抗腫瘤作用機制及療效的深入探討，奠定了其堅實的藥學(xué)基礎(chǔ)，是對 Fv-LDP-AE 研發(fā)的一個有力推進。

[1] Benjamin MM, Khalil RA. Matrix metalloproteinase inhibitors as investigative tools in the pathogenesis and management of vascular disease. EXS, 2012, 103:209-279.

[2] Roomi MW, Monterrey JC, Kalinovsky T, et al. Patterns of MMP-2 and MMP-9 expression in human cancer cell lines. Oncol Rep, 2009, 21(5):1323-1333.

[3] Cheng XS, Yang ZB, Yin ZF. Matrix metalloproteinases and epithelial-mesenchymal transition in tumor: an advance. Chin J Cancer Biother, 2011, 18(4):437-440. (in Chinese)

程先碩, 楊之斌, 殷正豐. 基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究進展. 中國腫瘤生物治療雜志, 2011, 18(4):437-440.

[4] Pellikainen JM, Ropponen KM, Kataja VV, et al. Expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in breast cancer with a special reference to activator protein-2, HER2, and prognosis. Clin Cancer Res, 2004, 10(22):7621-7628.

[5] Liu Z, Li L, Yang Z, et al. Increased expression of MMP9 is correlated with poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma. BMC Cancer, 2010, 10:270. doi: 10.1186/1471-2407-10-270.

[6] Dong W, Li H, Zhang Y, et al. Matrix metalloproteinase 2 promotes cell growth and invasion in colorectal cancer. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2011, 43(11):840-848.

[7] Zhao F, Zhang Q, Kang C, et al. Suppression of matrix metalloproteinase-9 expression by RNA interference inhibits SGC7901 gastric adenocarcinoma cell growth and invasion in vitro and in vivo. Med Oncol, 2010, 27(3):774-784.

[8] Roy R, Yang J, Moses MA. Matrix metalloproteinases as novel biomarkers and potential therapeutic targets in human cancer. J Clin Oncol, 2009, 27(31):5287-5297.

[9] Huang YH, Shang BY, Zhen YS. Antitumor efficacy of lidamycin on hepatoma and active moiety of its molecule. World J Gastroenterol, 2005, 11(26):3980-3984.

[10] Zhen YS, Ming XY, Yu B, et al. A new macromolecular antitumor antibiotic, C-1027. III. Antitumor activity. J Antibiot (Tokyo), 1989, 42(8):1294-1298.

[11] Shao RG, Zhen YS. Enediyne anticancer antibiotic lidamycin: chemistry, biology and pharmacology. Anticancer Agents Med Chem, 2008, 8(2):121-131.

[12] Otani T, Minami Y, Marunaka T, et al. A new macromolecular antitumor antibiotic, C-1027. II. Isolation and physico-chemical properties. J Antibiot (Tokyo), 1988, 41(11):1580-1585.

[13] Gao RJ, Li DD, Zhen YS. Study on mechanisms of action of enediyne antitumor antibiotic lidamycin. Chin J New Drugs, 2006, 15(13): 1039-1043. (in Chinese)

高瑞娟, 李電東, 甄永蘇. 烯二炔類抗腫瘤抗生素力達霉素的作用機制研究進展. 中國新藥雜志, 2006, 15(13):1039-1043.

[14] Shao RG, Zhen YS. Relationship between the molecular composition of C1027, a new macromolecular antibiotic with enediyne chromophore, and its antitumor activity. Acta Pharm Sinica, 1995, 30(5):336-342. (in Chinese)

邵榮光, 甄永蘇. 新烯二炔類大分子抗腫瘤抗生素C1027的分子構(gòu)成與活性關(guān)系. 藥學(xué)學(xué)報, 1995, 30(5):336-342.

[15] Gao RJ, Zhao CY, Wang YF, et al. Comparison of two kinds of protein determination methods for fusion protein Fv-LDP in the recombinant strain. Chin J New Drugs, 2010, 19(4):280-283, 331. (in Chinese)

高瑞娟, 趙春燕, 王玉鳳, 等. 兩種重組菌中融合蛋白Fv-LDP含量測定方法的比較研究. 中國新藥雜志, 2010, 19(4):280-283, 331.

[16] Gao RJ, Zhao CY, Wang YF, et al. Fermentation process of single-chain Fv antibody and lidamycin apoprotein expressed in Escherichia coli. Chin J Antibiotics, 2009, 34(4):210-214, 237. (in Chinese)

高瑞娟, 趙春燕, 王玉鳳, 等. 單鏈抗體與力達霉素輔基蛋白在大腸埃希菌表達的發(fā)酵工藝. 中國抗生素雜志, 2009, 34(4):210-214, 237.

[17] Gao RJ, Zhao CY, Wang YF, et al. High cell-density fermentation of the engineered strain and immunological activity of the fusion protein composed of single-chain Fv antibody and lidamycin apoprotein. Chin J Antibiotics, 2009, 34(9):536-540. (in Chinese)

高瑞娟, 趙春燕, 王玉鳳, 等. 單鏈抗體與lidamycin輔基蛋白融合蛋白工程菌的高密度發(fā)酵及其免疫活性. 中國抗生素雜志, 2009, 34(9):536-540.

[18] Gao RJ, Zhao CY, Li DD, et al. Optimization of the preparation process for fusion protein Fv-LDP that composes lidamycin apoprotein and single-chain Fv antibody directed against type IV collagenase. Acta Pharm Sinica, 2013, 48(10):1563-1569. (in Chinese)

高瑞娟, 趙春燕, 李電東, 等. 單鏈抗體與力達霉素輔基蛋白融合蛋白制備過程的優(yōu)化. 藥學(xué)學(xué)報, 2013, 48(10):1563-1569.

[19] Zhong G, Zhang S, Li Y, et al. A tandem scFv-based fusion protein and its enediyne-energized analogue show intensified therapeutic efficacy against lung carcinoma xenograft in athymic mice. Cancer Lett, 2010, 295(1):124-133.

[20] Xu H, Wei Y, Zhang Y, et al. Oestrogen attenuates tumour progression in hepatocellular carcinoma. J Pathol, 2012, 228(2):216-229.

[21] Jiao Y, Sun KK, Zhao L, et al. Suppression of human lung cancer cell proliferation and metastasis in vitro by the transducer of ErbB-2.1 (TOB1). Acta Pharmacol Sin, 2012, 33(2):250-260.

[22] Reisfeld RA. The tumor microenvironment：a target for combination therapy of breast cancer. Crit Rev Oncog, 2013, 18(1-2):115-133.

[23] Gao RJ, Li L, Zhao CY, et al. Antitumor effect of the engineered and energized fusion protein Fv-LDP-AE composed of lidamycin and anti-type IV collagenase single-chain Fv antibody. Chin Pharm J, 2010, 45(11):808-813. (in Chinese)

高瑞娟, 李亮, 趙春燕, 等. 單鏈抗體與力達霉素基因工程強化融合蛋白Fv-LDP-AE的抗腫瘤作用. 中國藥學(xué)雜志, 2010, 45(11): 808-813.

[24] Sheng W, Shang Y, Miao Q, et al. Antitumor efficacy of the scFv-based fusion protein and its enediyne-energized analogue directed against epidermal growth factor receptor. Anticancer Drugs, 2012, 23(4):406-416.

[25] Sheng WJ, Shang Y, Li L, et al. An EGFR/CD13 bispecific fusion protein and its enediyne-energized analog show potent antitumor activity. Anticancer Drugs, 2014, 25(1):82-91.

[26] Liu X, He H, Feng Y, et al. Difference of cell cycle arrests induced by lidamycin in human breast cancer cells. Anticancer Drugs, 2006, 17(2):173-179.

[27] Zhen YZ, Lin YJ, Shang BY, et al. Enediyne lidamycin induces apoptosis in human multiple myeloma cells through activation of p38 mitogen-activated protein kinase and c-Jun NH2-terminal kinase. Int J Hematol, 2009, 90(1):44-51.

[28] Gao RJ, Liang YX, Li DD, et al. Effect of lidamycin on telomerase activity in human hepatoma BEL-7402 cells. Biomed Environ Sci, 2007, 20(3):189-197.

[29] Zhang SH, Zhang H, He HW, et al. Lidamycin up-regulates the expression of thymidine phosphorylase and enhances the effects of capecitabine on the growth and pulmonary metastases of murine breast carcinoma. Cancer Chemother Pharmacol, 2013, 72(4):777- 788.

Antitumor mechanismand efficacy of the fusion protein consisting of lidamycin and anti-gelatinases single-chain Fv antibody

GAO Rui-juan, SHANG Bo-yang, SHENG Wei-jin, ZHAO Chun-yan, LI Dian-dong, ZHEN Yong-su

To investigatethe antitumor mechanism and efficacy of the fusion protein Fv-LDP-AE composed of lidamycin (LDM) and anti-gelatinases single-chain Fv antibody.

Free AE (the active enediyne chromophore of LDM) prepared using the triple radial pressure C4column was reassembled into fusion protein Fv-LDP bymolecular reconstitution. The rebuilt fusion protein Fv-LDP-AE was obtained by Superdex 75 chromatography to remove the free AE. Reverse phase HPLC was used to determine the purity or the relative content of the drug components. DNA content was measured by flow cytometry. SA-β-gal staining, Western blot and cell wound healing assay were exploited to detect the effect of tested drugs on cell senescence, protein expression and cell migration, respectively. Antitumor efficacies of tested drugs were evaluated by different animal models.

Fv-LDP-AE inherited the action characteristics derived from LDM including the induction of cell cycle arrest, apoptosis and mitotic cell death in human hepatoma BEL-7402 and lung cancer PG-BE1 cells. Furthermore, Fv-LDP-AE also showed more potent activity than LDM in triggering cellular senescence and inhibiting cell migration in human cancer cells. The induction of cell apoptosis was related to the activation of caspases signaling pathway and the inhibition of migration was associated with the down-regulation of MMP-2 in Fv-LDP-AE-treated BEL-7402 cells., Fv-LDP-AE also suppressed the growth of murine tansplantable hepatoma 22 (H22) and human hepatoma BEL-7402 xenograft in athymic mice with the inhibition rate of 86.6% and 82.5%, respectively.

Fv-LDP-AE showes antitumor effects against murine transplantable tumor and cancer xenograft in athymic mice, which may be related to the induction of cell cycle arrest, death and senescence as well as the inhibition of cell migration by Fv-LDP-AE in tumor cells.

Gelatinases; Single-chain antibodies; Tumor microenvironment; Lidamycin

ZHEN Yong-su, Email: zhenys@public.bta.net.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.002

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2009ZX09103-136、2013ZX09102064）；國家自然科學(xué)基金（81001021）

甄永蘇，Email：zhenys@public.bta.net.cn

2014-02-12

Author Affiliation: Department of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China