劉婕，陳俊亨，徐天殊，王麗萍，趙琦

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大容量人源Fab噬菌體展示抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗CD276抗體篩選

劉婕，陳俊亨，徐天殊，王麗萍，趙琦

518055 深圳，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院抗體藥物研究中心（劉婕、陳俊亨、徐天殊、趙琦）；130012 長(zhǎng)春，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（陳俊亨、徐天殊、王麗萍）

構(gòu)建大容量人源 Fab 噬菌體庫(kù)，篩選并鑒定抗 CD276 的特異性抗體。

通過(guò)采集 10 位健康成人的外周血淋巴細(xì)胞，提取總 RNA，利用 RT-PCR 擴(kuò)增人 Fab 抗體基因片段，插入噬菌體載體 pCANTAB5H 中，構(gòu)建人源 Fab 噬菌體抗體庫(kù)。通過(guò)固相化的抗原對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行 3 輪篩選后，隨機(jī)挑取96 個(gè)單克隆進(jìn)行 phage-ELISA 鑒定，篩選出與抗原具有較強(qiáng)結(jié)合性的噬菌體克隆。

成功構(gòu)建庫(kù)容為 5 × 1010的噬菌體抗體庫(kù)，從中篩選到 11 株陽(yáng)性克隆，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序鑒定，表明該 11 株克隆的序列均一致，ELISA 證實(shí)其對(duì)抗原 CD276 具有較強(qiáng)的結(jié)合性。

構(gòu)建了大容量人源 Fab 抗體庫(kù)，從中獲得具有抗 CD276 的人源 Fab 抗體片段，為進(jìn)一步的研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

免疫球蛋白 Fab 片段； 噬菌體展示抗體庫(kù)； CD276

CD276，又叫 B7-H3，是 2001 年在人樹(shù)突狀細(xì)胞 cDNA 文庫(kù)中鑒定出的B7 超家族共信號(hào)分子[1]。近年來(lái)的研究表明共信號(hào)分子不僅能提供T 細(xì)胞活化所需的共信號(hào)分子促進(jìn) T 細(xì)胞免疫應(yīng)答[2]，在抗炎和抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)也可以提供下調(diào)免疫應(yīng)答的負(fù)性共信號(hào)分子，維持 T 細(xì)胞免疫耐受，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[3-5]。而 CD276 在正常組織、細(xì)胞中不表達(dá)或極低表達(dá)，高表達(dá)于多種腫瘤組織中[6]。本文以 CD276 為靶標(biāo)，利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)克隆出全套人源抗體基因，并在噬菌體表面表達(dá)，構(gòu)建大容量人源 Fab 抗體庫(kù)，并從中篩選出特異性抗 CD276 的 Fab 抗體片段，為腫瘤藥物的研制提供新的候選因子。

1 材料與方法

1.1 材料

噬菌體載體 pCANTAB5H 通過(guò)對(duì)商用載體 pCANTAB5E 進(jìn)行酶切位點(diǎn)改造獲得[7]；大腸桿菌 TG1 購(gòu)自美國(guó)Lucigen 公司；HB2151 細(xì)菌由香港大學(xué)張美云教授惠贈(zèng)；Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA 連接酶購(gòu)自中國(guó)NEB 公司；Trizol、DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó) Qiagen 公司；RT-PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；HRP 標(biāo)記的鼠抗 Flag 抗體購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的鼠抗 M13 抗體和淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó) GE Healthcare 公司；CD276 蛋白購(gòu)自美國(guó)R & D 公司；人外周血淋巴細(xì)胞來(lái)自 10 位健康人捐獻(xiàn)的 2 L 外周血，采用 Ficoll 密度梯度離心分離；所有引物由美國(guó)Life Technologies 中國(guó)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人外周血淋巴細(xì)胞總 RNA 的抽提及 RT-PCR 從采集的 10 個(gè)健康人的 2 L 血液分離出淋巴細(xì)胞，用 Trizol 試劑提取淋巴細(xì)胞總 RNA，按總 RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)所述步驟操作。以 Oligo(dT) 為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA，具體方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 重鏈和輕鏈基因的 PCR 擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[8]提供的輕鏈及重鏈家族特異性引物序列組合進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增抗體 VH、λ 和κ片段編碼區(qū)。然后，VH和 CH1 通過(guò)重疊 PCR 進(jìn)行拼接獲得 Fd。再通過(guò)重疊 PCR 分別拼接 Fd 和λ 或κ片段，獲得Fab。PCR 的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化回收備用。

1.2.3 Fab 噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建 Fab 基因及 pCANTAB5H 載體質(zhì)粒分別用I 酶切，產(chǎn)物分別回收后進(jìn)行連接。連接物再經(jīng)脫鹽回收，電轉(zhuǎn)化感受態(tài) TG1 細(xì)菌，電轉(zhuǎn)化后迅速加入 2YT 培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng) 1 h，取 100 μl 經(jīng) 10 倍稀釋后鋪 2YT 平板檢測(cè)庫(kù)容，余下接入 250 ml 的 2YT 液體培養(yǎng)基（含 100 μg/ml 氨芐青霉素、1% 葡萄糖）中，37 ℃培養(yǎng) 6 h，加入輔助噬菌體侵染 1 h，去除培養(yǎng)基，接入 1 L 新 2YT 液體培養(yǎng)基（含 100 μg/ml 氨芐青霉素、50 μg/ml 卡那霉素）中，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日從培養(yǎng)液中以 PEG 沉淀噬菌體，加入甘油保存于–80 ℃。

1.2.4 噬菌體抗體庫(kù)的篩選 抗體庫(kù)篩選參照文獻(xiàn)[9]，將人重組 CD276 用 50 mmol/L 碳酸氫鈉（pH 10.0）包被 ELISA 板，PBS/2% 牛奶封閉后加入噬菌體庫(kù)，室溫緩搖 1 h，經(jīng) PBS/0.1% Tween 洗 6 次，酸性洗脫液（0.1 mmol/L HCl-Gly，pH 2.2，0.1% BSA）洗脫結(jié)合的噬菌體，再用 1 mol/L Tris-HCl（pH 9.1）中和洗脫液，測(cè)滴度，擴(kuò)增噬菌體用于下一輪篩選。共進(jìn)行 3 輪篩選，后 2 輪篩選過(guò)程同第一輪，但減少包被抗原量，并且逐漸增加 Tween 濃度，分別為 0.3%、0.5%。

單克隆噬菌體的篩選參考文獻(xiàn)[10]，挑取96 株經(jīng) 3 輪篩選獲得的陽(yáng)性克隆，接種于 100 μl 含 100 mg/L Amp 的 2YT 培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至600= 0.3 ~ 0.4，加入 25 μl 輔助噬菌體進(jìn)行侵染，然后加入 25 μl 含300 mg/L Kan 的 2YT 培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。富集的各個(gè)噬菌體克隆采用 ELISA 方法進(jìn)行特異性鑒定，每孔包被人重組 CD276 100 ng，加 100 μl 噬菌體，HRP 標(biāo)記的鼠抗 M13 抗體顯色。

1.2.5 Fab抗體的表達(dá)和純化 參考文獻(xiàn)[7]，在 HB2151 細(xì)菌中可溶性表達(dá) Fab 抗體，0.5 mol/L 的 IPTG 低溫誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜，利用滲透壓休克法從細(xì)菌周質(zhì)腔獲取可溶性 Fab，鎳柱純化獲得 Fab 蛋白，SDS-PAGE 鑒定純度。

1.2.6 ELISA 分析 純化的 Fab 抗體采用ELISA 方法進(jìn)行特異性分析，每孔包被人重組 CD276、IGF1R、gp120 和 BSA 各 100 ng，加梯度稀釋的 Fab 抗體，HRP 標(biāo)記的鼠抗 Flag 抗體顯色。

2 結(jié)果

2.1 Fd 段、λ 鏈、κ 鏈的 PCR 擴(kuò)增及 Fab 組裝

PCR 分別擴(kuò)增 IgM 重鏈可變區(qū)基因、輕鏈 λ、輕鏈 κ 基因。分別獲得 IgM 和 IgG 的 6 種重鏈可變區(qū)基因，9 種輕鏈 λ 基因，6 種輕鏈 κ 基因，片段大小如圖 1A 所示。重鏈可變區(qū)與 CH1 組建 Fd 片段，最后與輕鏈 λ 或 κ 基因通過(guò)重疊 PCR 構(gòu)建成 1.6 kb 的 Fab 片段（圖 1B）。

bpκ λ IgG IgMVH VH kbκ-Fab λ-Fab 800600 400A 1.61.0 B

Figure 1 PCR amplification of Fd, λ and κ fragments (A) and assembly of Fab fragments by overlapping PCR (B)

2.2 Fab 噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建

膠純化的 Fab 產(chǎn)物經(jīng)I 酶切、回收純化后與 pCANTAB5H 連接，并電轉(zhuǎn)化至 TG1 菌中，構(gòu)建 Fab 抗體庫(kù)。根據(jù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在 2YT 平皿上長(zhǎng)出的克隆數(shù)，確定其轉(zhuǎn)化子數(shù)為 5 × 1010。將電穿孔轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)，以輔助噬菌體感染，得到含有噬菌體抗體的上清，經(jīng) PEG 沉淀濃縮后獲得噬菌體抗體庫(kù)。

2.3 CD276 特異性噬菌體的篩選

進(jìn)行 3 輪篩選，第一輪篩選采用低篩選強(qiáng)度，獲得所有與抗原結(jié)合的噬菌體克隆，目的是除去大部分與抗原無(wú)親和力的噬菌體，所獲得的大部分噬菌體結(jié)合強(qiáng)度較弱。三輪篩選中，噬菌體經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，拷貝數(shù)明顯增加，并且將去污劑 Tween 的濃度逐輪增大（0.1%、0.3%、0.5%），增加沖洗次數(shù)，逐步增加篩選壓力。最終富集的噬菌體的富集指數(shù)提高到 100，說(shuō)明已經(jīng)成功地富集了與 CD276 具有高親和性的噬菌體（表 1）。

在第三輪篩選富集到的噬菌體中，隨機(jī)挑選 96 個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)其與 CD276 抗原行 ELISA 測(cè)定，篩選到 11 個(gè)噬菌體克隆顯示出與抗原的高結(jié)合性（圖 2）。挑選特異性最好的陽(yáng)性克隆用于進(jìn)一步的測(cè)序鑒定。

表 1 CD276 篩選的富集效應(yīng)

注：a：富集指數(shù) =（后一輪 O/I）/（前一輪 O/I）

Note: a: Enrichment factor = (Roundn+1Output/Input)/(RoundnOutput/Input)

OD450

Figure 2 ELISA screening of anti-CD276 phage clones

kD 1 2 3 28 15A

OD4502.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 10 20 30 40 50 抗體濃度（μg/ml）Antibody concentration (μg/ml)B

1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2~3：抗 CD276 抗體 Fab

1: Protein marker; 2 -3: anti-CD276 Fab

圖 3 抗 CD276 抗體 Fab 的表達(dá)純化結(jié)果（A）和 ELISA 分析結(jié)果（B）

Figure 3 SDS-PAGE (A) and ELISA (B) of purified anti-CD276 Fab against different antigens

2.4 抗 CD276 抗體 Fab 的表達(dá)及結(jié)合性分析

測(cè)序結(jié)果顯示所有克隆的序列是相同的，重鏈屬于 V3 家族，輕鏈屬于 VK1 家族。在 HB2151 細(xì)菌中可溶性表達(dá) Fab 抗體，經(jīng)鎳離子樹(shù)脂純化后，SDS-PAGE 鑒定蛋白的純度可達(dá) 95% 以上（圖 3A）。為進(jìn)一步證實(shí)抗體的特異性，CD276 抗原和對(duì)照蛋白（IGF1R、gp120 和 BSA）包被 ELISA 板，分析結(jié)果顯示 Fab 抗體可以特異性地結(jié)合 CD276 抗原，不與其他非相關(guān)蛋白結(jié)合（圖 3B）。

3 討論

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)以 PCR 技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)為基礎(chǔ)，通過(guò)構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)經(jīng)抗原篩選得到特異性抗體成為獲得人源抗體分子的有效途徑[11]。抗體庫(kù)技術(shù)利用抗原即可直接從非免疫抗體庫(kù)中得到全人源特異性抗體，并且能篩選到針對(duì)該物種自身抗原的抗體，克服了難以用雜交瘤技術(shù)的障礙。被廣泛地運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室研究、疾病的診斷與治療。

從天然抗體庫(kù)中成功篩選出相應(yīng)抗體，關(guān)鍵是保證抗體庫(kù)中的抗體基因具有足夠數(shù)量及多樣性[12]。本研究收集 10 位健康人外周血分離淋巴細(xì)胞，保障抗體基因的全面和多樣性，為成功地構(gòu)建大庫(kù)容量的抗體庫(kù)提供了基本的保證。為了盡可能全面地?cái)U(kuò)增出抗體家族各成員的抗體片段，選擇擴(kuò)增了所有 IgG 和 IgM 的重鏈家族，盡管在人體內(nèi)輕鏈 λ 鏈的抗體僅占 40%，為了在擴(kuò)增過(guò)程中減少遺漏，同時(shí)也擴(kuò)增了包括 κ 和 λ 在內(nèi)的所有輕鏈成員。從理論上講，F(xiàn)ab 片段的結(jié)構(gòu)與天然抗體的抗原結(jié)合部位最為相似，因此選取噬菌體展示的抗體形式。有報(bào)道認(rèn)為天然抗體庫(kù) 1010的庫(kù)容就可能包容所有的抗體[13]，本研究構(gòu)建的抗體庫(kù)容量為5 × 1010，可以保證得到高特異性的人源抗體。

CD276 是新近發(fā)現(xiàn)的共刺激分子 B7 家族的一個(gè)新成員，在 T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用，在正常組織、細(xì)胞中不表達(dá)或極低表達(dá)，高表達(dá)于多種腫瘤組織中[6]。以CD276 作為靶抗原，對(duì) Fab 噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行了 3 輪吸附-洗脫-擴(kuò)增的淘選富集。通過(guò)測(cè)定各級(jí)庫(kù)的滴度和洗脫下來(lái)的噬菌體的產(chǎn)出率，計(jì)算噬菌體抗體庫(kù)得到了約 10 倍的富集，表明 CD276 對(duì)所構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)表面呈現(xiàn)抗體的噬菌體起到了淘選富集作用。經(jīng)過(guò) 96 孔的單克隆 ELISA 分析和可溶性表達(dá)，獲得高純度的 Fab 抗體用于親和性分析。最終鑒定了一個(gè) Fab 抗體可以與 CD276 高親和性結(jié)合，這些結(jié)果證實(shí)從 Fab 噬菌體抗體庫(kù)中獲得特異性人源抗體的可行性。

本研究通過(guò)提取總 RNA 進(jìn)行 RT-PCR 等生物學(xué)技術(shù)初步獲得了一個(gè)大容量的人源抗體庫(kù)，并且初步篩選得到一個(gè)抗腫瘤抗原 CD276 的單克隆抗體，為進(jìn)一步的研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Construction of a large human Fab phage display antibodies library and screening of phage antibodies against CD276

LIU Jie, CHEN Jun-heng, XU Tian-shu, WANG Li-ping, ZHAO Qi

To construct a large human Fab antibodies library and to screen and identify the anti-CD276 phage antibodies from the library.

Total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes of 10 healthy donors, and the Fab antibody genes were amplified by RT-PCR. The amplification products were sequentially cloned into phage vector pCANTAB5E to construct a human Fab phage antibodies library. Antibodies against CD276 were screened using immobilized antigen. After three rounds of screening, 96 randomly selected clones were identified by phage-ELISA to select specific ones with high affinity for CD276.

A large human Fab phage-display library consisting of 5 × 1010members was successfully constructed. From the phage library, we obtained eleven positive clones which had specificity and binding reactivity towards CD276. By sequencing, all of the 11 clones had the same sequences, and their specificity was confirmed by ELISA.

We successfully constructed a large human Fab phage antibodies library and isolated the specific human anti-CD276 Fab antibodies, which provided an experimental foundation in future study and application.

Immunoglobulin Fab fragments; Phage display antibody library; CD276

ZHAO Qi, Email: qi.zhao@siat.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.005

諾和諾德-中科院專項(xiàng)研究經(jīng)費(fèi)（NNCAS-2013-9）

趙琦，Email：qi.zhao@siat.ac.cn

2014-06-13

Author Affiliations: Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, China (LIU Jie, CHEN Jun-heng, XU Tian-shu, ZHAO Qi); College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China (CHEN Jun-heng, XU Tian-shu, WANG Li-ping)