何含杰，施和平

1 中南林業(yè)科技大學生命科學與技術(shù)學院 林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室/生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410004

2 華南師范大學生命科學學院 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東 廣州 510631

三裂葉野葛Pueraria phaseoloides，系豆科多年生藤本植物，其根含有葛根素、大豆苷等異黃酮類化合物，具有改善心腦血循環(huán)、降低血脂與血糖、增強免疫力等功能及具有類似雌性激素的功效，廣泛用于治療高血壓、冠心病、心絞痛等病癥[1-2]。但由于其野生資源的匱乏以及人工栽培的時效性差而無法滿足醫(yī)藥工業(yè)的巨大需求。為此，我們曾利用含野生型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834對三裂葉野葛葉片進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了能在無激素 MS培養(yǎng)基上自主快速生長及能產(chǎn)生較高含量葛根素的毛狀根[3]。已有的研究結(jié)果表明，植物毛狀根的生長和次生代謝物質(zhì)的合成與積累易受到培養(yǎng)基類型、植物激素等諸多因素的影響[4-7]。細胞分裂素和生長素參與和調(diào)控了植物許多重要的生理過程，如器官的發(fā)育與衰老、藥用植物的生長和次生代謝以及基因的表達調(diào)控等[8-11]。如在供試的培養(yǎng)基中添加不同的外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以促進雪蓮Saussurea involucrata毛狀根和亞麻 Linum album毛狀根的生長和次生代謝物的生物合成與積累[4,12]。但迄今為止未見有關(guān)生長素和細胞分裂素對三裂葉野葛毛狀根生長和異黃酮含量影響的報道。本文報道細胞分裂素6-BA和生長素NAA對三裂葉野葛毛狀根生長和異黃酮化合物含量的影響，旨在為運用植物激素來調(diào)節(jié)三裂葉野葛毛狀根的生長和葛根素等異黃酮類物質(zhì)的合成與積累奠定實驗和技術(shù)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本文所采用的材料是由含野生農(nóng)桿堿型 Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834遺傳轉(zhuǎn)化三裂葉野葛葉片外植體所產(chǎn)生的毛狀根，其誘導和繼代培養(yǎng)方法見已發(fā)表方法[3]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

采用的培養(yǎng)基為添加不同濃度 6-BA或6-BA＋2.0 mg/L NAA組合的固體MS培養(yǎng)基，其中6-BA濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、3.0和5.0 mg/L，每個150 mL錐形瓶中分裝40 mL培養(yǎng)基。滅菌前pH值調(diào)至5.8?6.0，經(jīng)121 ℃、20 min高溫濕熱滅菌后待用。接種后，毛狀根置于培養(yǎng)架上，于 (25±2)℃暗培養(yǎng)。

1.3 三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)及其生物量測定

選取生長旺盛的三裂葉野葛毛狀根，用無菌水洗去培養(yǎng)基后，剪切成4?5 cm且具根尖的根段，按約0.5 g/瓶接入含植物激素的MS固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔5 d隨機抽取毛狀根培養(yǎng)物各 3瓶，用自來水洗去培養(yǎng)物上的培養(yǎng)基，并用吸水紙吸干水分后測定毛狀根的鮮重和干重。一部分毛狀根培養(yǎng)物于–80 ℃超低溫冰箱中保存，供測定其可溶性蛋白含量和保護酶活性及提取植物基因組DNA；另一部分毛狀根在恒溫烘箱中60 ℃烘干后，供測定其異黃酮化合物含量。

1.4 三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)物中異黃酮化合物含量的測定

三裂葉野葛毛狀根中異黃酮化合物含量的測定，參照我們已發(fā)表的方法[3]。

1.5 毛狀根培養(yǎng)物中可溶性蛋白含量、SOD和POD活性的測定

三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)物中可溶性蛋白含量的測定參照 Bradford的方法。用考馬斯亮藍G-250對制備好的酶液進行染色，搖勻后于島津UV-1206型紫外光/可見光分光光度儀上 (595 nm)測定其光吸收值 (OD)，同時以制備提取液所用的磷酸緩沖液作為空白對照[13]。SOD活性的測定參照 Beauchamp和 Fridovich的方法進行操作，以抑制NBT光還原50%所需要的酶量為一個酶活性單位，酶活性以 U/mg蛋白表示[14]。POD活性的測定參照已發(fā)表的方法[15]。

1.6 毛狀根基因組DNA的提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測

三裂葉野葛毛狀根基因組DNA的提取，參照文獻[3]。瓊脂糖凝膠電泳檢測條件是：1%瓊脂糖，1×50 TEB，50 V，1.5 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA對三裂葉野葛毛狀根生長的影響

無激素MS培養(yǎng)基 (對照)培養(yǎng)的三裂葉野葛毛狀根生長最快，培養(yǎng)至25 d時其干重達到最大，約為1.47 g DW/瓶；隨著培養(yǎng)時間的延長，毛狀根逐漸褐化，其生物量也開始下降 (圖1 A)。與對照相比，細胞分裂素6-BA明顯抑制三裂葉野葛毛狀根的生長，降低其生物量，且此抑制作用與6-BA濃度呈正相關(guān)；培養(yǎng)至30 d時，添加6-BA培養(yǎng)基培養(yǎng)的三裂葉野葛毛狀根的干重雖達到最大值，但僅為同期對照生物量的26.3%?47.8% (圖1 A)；其中低濃度0.1 mg/L 6-BA可以抑制毛狀根側(cè)根的產(chǎn)生，促進老根的褐化與衰老；而5.0 mg/L 6-BA則完全抑制毛狀根的生長，老根逐漸變成黑色或逐漸膨大且似愈傷化 (圖1 B、C、D)，表明6-BA可抑制三裂葉野葛毛狀根的生長，降低毛狀根的生物量。

2.2 6-BA對三裂葉野葛毛狀根異黃酮化合物含量的影響

圖1 6-BA或6-BA和NAA結(jié)合對三裂葉野葛毛狀根生長的影響Fig. 1 Effects of 6-BA or in combination with NAA on the growth of P. phaseoloides hairy roots. (A)Effect of 6-BA on the biomass of P. phaseoloides hairy roots. (B), (C), (D)Treatment with 6-BA. (E), (F), (G)Treatment with 6-BA and NAA 2.0 mg/L combination, the 6-BA concentrations was 0 mg/L in (B), 0.1 mg/L in (C)and (E), 1.0 mg/L in (F), 5.0 mg/L in (D)and (G)(15 d).

圖2為6-BA濃度對三裂葉野葛毛狀根異黃酮化合物含量的影響。從圖 2可見，對照毛狀根培養(yǎng)物中異黃酮化合物呈先上升后下降的變化趨勢，培養(yǎng)至10 d時，毛狀根每克干物質(zhì)中異黃酮化合物含量達到最高，約為32.22 mg/g DW(圖2 A)。與對照相比，培養(yǎng)至25 d時，細胞分裂素6-BA 0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L和5.0 mg/L處理的毛狀根每克干物質(zhì)中異黃酮化合物含量分別是對照含量的1.2、1.7、1.8、1.7和1.7倍 (圖2 A)。然而，細胞分裂素6-BA卻降低每個培養(yǎng)瓶中毛狀根的總異黃酮化合物的含量；培養(yǎng)至30 d時，培養(yǎng)瓶中總異黃酮化合物的含量是同期對照含量的47.8%?68.6% (圖2 B)。這表明6-BA可降低每個培養(yǎng)瓶中毛狀根的總異黃酮化合物含量。

2.3 6-BA和NAA結(jié)合對三裂葉野葛毛狀根生長的影響

從圖3可見，對照三裂葉野葛毛狀根生長最快，培養(yǎng)至20 d時其干物質(zhì)量達到最大值，約為1.0 g DW/瓶，是培養(yǎng)初期的10.1倍 (圖3A)。而6-BA 0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L和NAA 2.0 mg/L結(jié)合培養(yǎng)的毛狀根則生長緩慢，培養(yǎng)至25 d時其干物質(zhì)量達到最大值，其干重分別比起始培養(yǎng)時增加了6.1、5.6、5.3、4.8和 4.6倍，但僅為同期對照毛狀根生物量的83.7%、78.0%、74.5%、68.4%和66.4% (圖3)。培養(yǎng)5 d后，低濃度6-BA (0.1 mg/L和1.0 mg/L)和NAA 2.0 mg/L結(jié)合培養(yǎng)的三裂葉野葛毛狀根的老根 (起始根端)上長出許多粗短的側(cè)根，且隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增多；培養(yǎng)20 d后毛狀根從白色變?yōu)辄S色 (圖1E、F)。相反，高濃度的6-BA 5.0 mg/L和NAA 2.0 mg/L結(jié)合則抑制毛狀根的生長，其起始根段逐漸褐化和膨大(圖 1G)。與對照相比，6-BA和 NAA 2.0 mg/L結(jié)合抑制三裂葉野葛毛狀根的生長，且其抑制作用與6-BA的濃度成正比 (圖3)。表明細胞分裂素6-BA和生長素NAA結(jié)合抑制三裂葉野葛毛狀根的生長，且NAA具有協(xié)同作用。

圖2 6-BA對三裂葉野葛毛狀根異黃酮含量的影響Fig. 2 Effects of 6-BA on the contents of isoflavones in P. phaseoloides hairy roots. (A)Isoflavones contents per gram in dry cultures of P. phaseoloides hairy roots. (B)Total isoflavones contents per flask in dry cultures of P. phaseoloides hairy roots.

2.4 6-BA和 NAA結(jié)合對毛狀根中異黃酮化合物含量的影響

圖3 6-BA和NAA對三裂葉野葛毛狀根生長的影響Fig. 3 Effects of 6-BA and NAA on the growth of P. phaseoloides hairy roots.

圖4 6-BA和NAA對三裂葉野葛毛狀根異黃酮化合物含量的影響Fig. 4 Effects of 6-BA and NAA on the contents of isoflavones in P. phaseoloides hairy roots. (A)Isoflavones contents per gram in dry cultures of P. phaseoloides hairy roots. (B)Total isoflavones contents per flask in dry cultures of P. phaseoloides hairy roots.

圖4為6-BA和NAA結(jié)合對三裂葉野葛毛狀根異黃酮化合物含量的影響。從圖 4可見，培養(yǎng)至25 d時，對照毛狀根培養(yǎng)物的異黃酮化合物含量達到最大值，約19.76 mg/g DW (圖4 A)。與對照相比，不同濃度6-BA和NAA 2.0 mg/L結(jié)合則可促進毛狀根每克干物質(zhì)中異黃酮化合物的積累，且其促進作用隨著 6-BA濃度的增加而愈加顯著；培養(yǎng)至20 d時，6-BA和NAA組合處理的毛狀根異黃酮化合物含量是同期對照含量的96.9%?131.7% (圖4 A)。但若以每瓶異黃酮含量計，6-BA和NAA組合處理則降低每個培養(yǎng)瓶的毛狀根總異黃酮化合物的含量，培養(yǎng)至25 d時，其總異黃酮化合物含量約為同期對照含量的 74.8%?89.6% (圖 4 B)。這表明，6-BA和NAA組合不僅抑制三裂葉野葛毛狀根的生長，而且降低每個培養(yǎng)瓶中毛狀根的總異黃酮化合物含量。

2.5 6-BA和 NAA結(jié)合對三裂葉野葛毛狀根的可溶性蛋白含量的影響

圖5為6-BA和NAA結(jié)合對毛狀根中可溶性蛋白含量的影響。從圖 5可見，對照三裂葉野葛毛狀根的可溶性蛋白含量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸下降，培養(yǎng)至25 d時其含量比起始水平下降約37.9%。與對照相比，6-BA 0.1、0.5、1.0、3.0或5.0 mg/L和NAA 2.0 mg/L組合處理的毛狀根培養(yǎng)物的可溶性蛋白含量在培養(yǎng)至15 d時到達最大值，且分別比對照提高49.5%、47.5%、30.2%、52.6%和46.5%；隨后其可溶性蛋白含量開始逐漸下降；培養(yǎng)至25 d時達到最低值，但其含量均比同期對照高 (圖 5)。該結(jié)果表明，6-BA和NAA可以提高三裂葉野葛毛狀根的可溶性蛋白的含量，推測其可能與毛狀根的生長受到抑制有關(guān)。

2.6 6-BA和NAA對三裂葉野葛毛狀根SOD活性的影響

圖6為6-BA和NAA對三裂葉野葛毛狀根SOD活性的影響。從圖6可見，對照三裂葉野葛毛狀根中SOD的活性隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高，培養(yǎng)至25 d時達到最大值，是培養(yǎng)初期 SOD活性的 1.6倍。與對照相比，培養(yǎng)15 d時，6-BA和NAA結(jié)合處理的毛狀根SOD活性達到最低值 (P＜0.01)，隨后又開始逐漸升高；培養(yǎng)至 25 d時，不同濃度 6-BA和 NAA 2.0 mg/L結(jié)合處理的毛狀根SOD活性分別是其培養(yǎng)初期的1.5、1.9、1.9、1.5和1.8倍，但僅是同期對照SOD活性的82.9%、89.5%、82.0%、69.0%和78.6% (圖6)?？梢娫??25 d培養(yǎng)期間，6-BA和NAA結(jié)合處理的毛狀根SOD活性都低于同期對照，這表明，6-BA和NAA結(jié)合可以降低三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)物的SOD活性。

圖5 6-BA和NAA對三裂葉野葛毛狀根中可溶性蛋白含量的影響Fig. 5 Effects of 6-BA and NAA on the contents of soluble protein in P. phaseoloides hairy roots.

2.7 6-BA和NAA對三裂葉野葛毛狀根POD活性的影響

圖7為6-BA和NAA結(jié)合對三裂葉野葛毛狀根POD活性的影響。從圖7可見，不同濃度6-BA和NAA 2.0 mg/L結(jié)合培養(yǎng)的三裂葉野葛毛狀根POD活性，隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高，且均高于對照活性水平。培養(yǎng)至25 d時，其POD活性達到最大值，6-BA 0.1、0.5、1.0、3.0、5.0和NAA 2.0 mg/L組合培養(yǎng)的毛狀根培養(yǎng)物POD活性比培養(yǎng)5 d時分別增加了2.8、4.6、3.0、4.5和3.2倍，分別是同期對照活性水平的1.3、1.9、1.6、1.7 和 1.3 倍 (P＜0.05)(圖 7)。這說明6-BA和NAA可以提高三裂葉野葛毛狀根的POD活性，且其活性水平與毛狀根生長受抑制程度和培養(yǎng)時間成正比。

2.8 6-BA和NAA對三裂葉野葛毛狀根PCD的影響

圖6 6-BA和NAA對三裂葉野葛毛狀根中SOD活性的影響Fig. 6 Effects of 6-BA and NAA on the activities of SOD in P. phaseoloides hairy roots.

圖7 6-BA和NAA對三裂葉野葛毛狀根POD活性的影響Fig. 7 Effects of 6-BA and NAA on the activities of POD in P. phaseoloides hairy roots.

圖8 6-BA和NAA處理后三裂葉野葛毛狀根中DNA片段的電泳檢測Fig. 8 Electrophoresis detection of DNA fragments in P. phaseoloides hairy roots under 6-BA and NAA treatment.(A)Detection of DNA fragments in P. phaseoloides hairy roots under 6-BA treatment alone. (B)Treatment with 6-BA and NAA 2.0 mg/L combination, the 6-BA concentrations was same in (A)and (B). M: marker; 1: 6-BA 0 mg/L; 2:6-BA 0.1 mg/L; 3: 6-BA 0.5 mg/L; 4: 6-BA 1.0 mg/L; 5: 6-BA 3.0 mg/L; 6: 6-BA 5.0 mg/L.

圖8為6-BA或6-BA和NAA結(jié)合處理對三裂葉野葛毛狀根PCD發(fā)生的影響。由圖8可見，6-BA處理的三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)至30 d時，通過瓊脂糖凝膠電泳可以檢測到140?200 bp大小的 DNA ladder，說明 6-BA可以誘導三裂葉野葛毛狀根 PCD的發(fā)生 (圖 8 A)。而 6-BA和 NAA結(jié)合處理的三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)至20 d時，可以檢測到DNA ladder，而培養(yǎng)至25 d時，其DNA ladder更加明顯，這說明6-BA和NAA可以誘導三裂葉野葛毛狀根PCD的發(fā)生，且NAA具有協(xié)同作用 (圖8 B)。

3 討論

已有的研究表明，毛狀根的生長及其次生代謝物質(zhì)的合成受到植物激素等因素的影響，但其影響程度因植物激素種類的不同而異[16]。NAA和IAA可顯著地促進人參Panax ginseng毛狀根的生長，而低濃度6-BA則可促進人參皂苷的合成和積累[17]。而NAA 1.0 mg/L和6-BA 1.0 mg/L結(jié)合則抑制酸漿果Physalis minima毛狀根的生長，促進其毛狀根培養(yǎng)物中澳洲茄胺的合成與積累，其含量約是對照含量的 3.6倍[18]。2,4-D可以強烈抑制何首烏Polygonum multiflorum毛狀根的生長和蒽醌類化合物的合成，而適量濃度的NAA和6-BA結(jié)合則可促進毛狀根的生長以及蒽醌類化合物的生物合成[8]。然而，在培養(yǎng)黃芩Scutellaria baicalensis毛狀根時觀察到，NAA可同時促進黃芩毛狀根的生長和黃芩苷的合成；而6-BA則只抑制黃芩毛狀根的生長，但有利于黃芩苷的合成和積累[19]。同時發(fā)現(xiàn)，NAA 0.5 mg/L則可以明顯提高紫雪花 Plumbago indica毛狀根培養(yǎng)物中磯松素的含量，但2,4-D則明顯抑制紫雪花毛狀根的生長和磯松素的合成與積累[20]。此外，KT 0.5 mg/L可以促進蕪菁Brassica rapa毛狀根中芥子油苷的積累，而對白芥Sinapis alba毛狀根次生代謝物的含量無明顯影響；但是，2,4-D (0.4 mg/L)不僅促進上述兩種毛狀根的生長，而且降低毛狀根培養(yǎng)物中芥子油苷的含量[21]。這表明植物生長調(diào)節(jié)劑對毛狀根的生長及其藥用成分合成與積累的調(diào)控作用可因植物種類和植物激素種類的不同而有所差異。在本實驗中，不同濃度的6-BA或6-BA和NAA結(jié)合均抑制三裂葉野葛毛狀根的生長，此抑制作用與6-BA的濃度成正相關(guān)，且NAA具有協(xié)同作用 (圖1、3)。雖然6-BA或6-BA和NAA結(jié)合可以促進三裂葉野葛毛狀根每克干物質(zhì)中異黃酮化合物的合成與積累，但是降低每個培養(yǎng)瓶中毛狀根的總異黃酮化合物含量(10%?26%)(圖2、4)。這表明6-BA或6-BA和NAA結(jié)合抑制三裂葉野葛毛狀根的生長，降低其毛狀根干物質(zhì)量和總異黃酮化合物含量，這與Putalun等的實驗結(jié)果基本一致[18]。

植物在受到傷害和逆境脅迫后，將開啟自身的防御機制，如提高SOD、POD等保護酶的活性水平，同時將體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧(Reactive oxygen species, ROS)成分轉(zhuǎn)化為H2O2和H2O，調(diào)整體內(nèi)ROS含量至基準水平而發(fā)揮保護作用[22]。在培養(yǎng)黃瓜 Cucumis sativus毛狀根時發(fā)現(xiàn)，6-BA可以延緩毛狀根中可溶性蛋白含量的下降，降低毛狀根SOD和POD活性水平，減少其內(nèi)源性乙烯的釋放量，從而調(diào)節(jié)毛狀根的生長和衰老[23]。外施6-BA能有效阻止棉花 Gossypium spp.葉片內(nèi)可溶性蛋白含量的迅速下降，提高葉片內(nèi)SOD活性水平，并延緩棉花幼苗的衰老[24]。與對照相比，6-BA和NAA結(jié)合提高三裂葉野葛毛狀根的可溶性蛋白的含量和POD活性水平，降低其體內(nèi)的SOD活性水平，這與 Shi等的實驗結(jié)果不一致 (圖 5、6、7)[23]。我們推測，這種差異可能與植物種類及毛狀根類型有關(guān)。

PCD是植物生長過程中一種重要的生理現(xiàn)象，并可受到許多因素的誘導和影響，如植物激素等[25-26]。高濃度激動素 KT (2.0 mg/L或4.0 mg/L KT)處理棉花懸浮細胞4 d后，不僅出現(xiàn)大量細胞死亡，而且可以檢測到 140?180 bp及其倍增的DNA ladder[27]。外施6-BA可以促進煙草 Nicotiana tabacum和胡蘿卜 Daucus carota細胞的衰老，誘導細胞PCD的發(fā)生，提高衰老相關(guān)基因 (Senescence-associated genes,SAG)SAG-12基因的表達水平，促進DNA ladder的形成[28]。實驗結(jié)果顯示，外源6-BA或6-BA和 NAA結(jié)合不僅抑制三裂葉野葛毛狀根的生長，而且促進毛狀根的衰老 (圖1、3)。外源6-BA或 6-BA和 NAA結(jié)合處理三裂葉野葛毛狀根20?30 d后，在毛狀根基因組DNA中均可以檢測到 140?200 bp或倍增的 DNA ladder，其中6-BA和NAA結(jié)合誘導的DNA ladder出現(xiàn)時間比6-BA單獨誘導的出現(xiàn)時間提前約10 d (圖8)。上述實驗結(jié)果說明，6-BA或6-BA和NAA均可以促進三裂葉野葛毛狀根 PCD的發(fā)生，而且NAA在6-BA誘導的PCD過程中具有協(xié)同作用。

細胞分裂素和生長素對植物生長發(fā)育過程的調(diào)控，最終是對靶基因和功能蛋白質(zhì)表達水平的調(diào)控[29]。利用植物激素處理大豆 Glycine max細胞時發(fā)現(xiàn)，生長素或細胞分裂素均抑制饑餓相關(guān)基因 (Starvation-associated messages,SAMs)SAM22/26/46的表達，誘導S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的上調(diào)表達，但二者結(jié)合使用時則無誘導效果[30]。細胞分裂素可通過受體蛋白CRE1/AHK4感知和應答其信號，然后通過多級磷酸化作用向下游傳遞信號，并最終誘導擬南芥培養(yǎng)細胞PCD的發(fā)生[26,31]。而在煙草細胞培養(yǎng)過程中，外源生長素可誘導激素響應基因pLS216在轉(zhuǎn)錄水平的短暫積累，而細胞分裂素的誘導效果則較生長素遲緩，這與本實驗結(jié)果不一致[32]。實驗結(jié)果表明，6-BA或6-BA和NAA結(jié)合不僅誘導三裂葉野葛毛狀根PCD的發(fā)生，而且NAA具有協(xié)同作用，但二者調(diào)控毛狀根的生長、異黃酮化合物的代謝、PCD發(fā)生及相關(guān)基因表達的機制則尚不清楚，待今后進一步研究。

[1]Wu DL, Chen ZY, Huang XX. A study of Chinese Pueraria. J Trop Subtrop Bot, 1994, 2(3): 12–21(in Chinese).吳德鄰, 陳忠毅, 黃向旭. 中國葛屬的研究. 熱帶亞熱帶植物學報, 1994, 2(3): 12–21.

[2]Guo JP, Sun QR, Zhou Q. Advances of pharmacological research of gegen. Chin Tradit Herb Drugs, 1995, 26(3): 163–165 (in Chinese).郭建平, 孫其榮, 周全. 葛根藥理作用研究進展.中草藥, 1995, 26(3): 163–165.

[3]Shi HP, Quan H, Spiroskintzios. Induction of hairy roots Pueraria phaseoloides and its culture in liquid and solid medium. Chin J Biotech, 2003,19(3): 307–311 (in Chinese).施和平, 權(quán)宏, Spiroskintzios. 三裂葉野葛毛狀根的誘導及其固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng). 生物工程學報, 2003, 19(3): 307–311.

[4]Qiao XL, Jiang SG, Lü XF, et al. Effects of phytohormones on plant regeneration and production of flavonoids in transgenic Saussurea involucrate hairy roots. Chin J Biotech, 2011,27(1): 69–75 (in Chinese).喬獻麗, 蔣曙光, 呂曉芬, 等. 激素對轉(zhuǎn)基因雪蓮毛狀根植株再生及類黃酮產(chǎn)生的影響. 生物工程學報, 2011, 27(1): 69–75.

[5]Yang R, Fu CX, Jin ZP, et al. Effects of physical and chemical factors on hairy root growth and flavonoids biosynthesis in the cultures of Saussurea medusa maxim hairy root. Chin J Biotech, 2005, 21(2): 233–238 (in Chinese).楊睿, 付春祥, 金治平, 等. 不同理化因子對雪蓮毛狀根生長和總黃酮生物合成的影響. 生物工程學報, 2005, 21(2): 233–238.

[6]He HJ, Liang P, Shi HP. Effects of sucrose and light on the growth and production of secondary metabolites in Pueraria phaseoloids hairy roots.Chin J Biotech, 2005, 21(6): 1003–1008 (in Chinese).何含杰, 梁朋, 施和平. 蔗糖和光對三裂葉野葛毛狀根生長及次生物質(zhì)產(chǎn)生的影響. 生物工程學報, 2005, 21(6): 1003–1008.

[7]Condori J, Sivakumar G, Hubstenberger J, et al.Induced biosynthesis of resveratrol and the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 in hairy root cultures of peanut: effects of culture medium and growth stage. Plant Physiol Biochem,2010, 48(5): 310–318.

[8]Yu RM, Ma N, Yan CY, et al. Effects of exogenous phytohormones on hairy root growth and biosynthesis of Anthraquinones in the hairy root culture of Polygonum multiflorum. Chin J Biotech, 2006, 22(4): 619–623 (in Chinese).于榮敏, 馬娜, 嚴春艷, 等. 外源激素對何首烏毛狀根生長及蒽醌類成分生物合成的影響. 生物工程學報, 2006, 22(4): 619–623.

[9]Wu T, Zhang HT, Wang Y, et al. Induction of root Fe(Ⅲ)reductase activity and proton extrusion by iron deficiency is mediated by auxin-based systemic signaling in Malus xiaojinensis. J Exp Bot, 2012, 63(2): 859–870.

[10]Hentrich M, Bottcher C, Duchting P, et al. The jasmonic acid signaling pathway is linked to anxin homeostasis through the modulation of YUCCA8 and YUCCA9 gene expression. Plant J, 2013,74(4): 626–637.

[11]Xu F, Yang Z, Chen X, et al.6-Benzylaminopurine delays senescence and enhances health-promoting compounds of harvested roccoli. J Agric Food Chem, 2012,60(1): 234–240.

[12]Farkya S, Bisaria VS. Exogenous hormones affecting morphology and biosynthetic potential of hairy root line (LYR2i)of Linum album. J Biosci Bioeng, 2008, 105(2): 140–146.

[13]Bradfoud MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem, 1976, 72: 248–252.

[14]Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase:improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal Biochem, 1979, 44(1):276–287.

[15]Shi HP, Eric PT, Wang YL, et al. Effect of cadmium, alone or in combination with CaCl2, on the growth, antioxidative enzyme activity and cadmium absorption of Solanum nigrum L. var pauciflorum hairy roots. Chin J Biotech, 2010,26(2): 147–158 (in Chinese).施和平, 曾寶強, 王云靈, 等. 鎘及其與鈣組合對褐脈少花龍葵毛狀根生長、抗氧化酶活性和吸收鎘的影響. 生物工程學報, 2010, 26(2):147–158.

[16]Fang CP, Wang WT, Wang ZF, et al. Effects of phytohormones on hairy root growth and tanshinone biosynthesis of Salvia miltiorrhiza. J Chin Med Mater, 2011, 34(5): 661–664 (in Chinese).房翠萍, 王維婷, 王志芬, 等. 植物激素對丹參毛狀根生長和丹參酮生物合成的影響. 中藥材,2011, 34(5): 661–664.

[17]Zhou QY, Ding JY, Liu J, et al. Effects of different phytohormones on the growth ad ginsenoside content of Panax ginseng hairy root. J Plant Resource Environ, 2003, 12(1): 26–28 (in Chinese).周倩耘, 丁家宜, 劉峻, 等. 植物激素對人參毛狀根生長和皂甙含量的影響. 植物資源與環(huán)境學報, 2003, 12(1): 26–28.

[18]Putalun W, Prasamsiwamai P, Tanaka H, et al.Solasodine glycoside production by hairy root cultures of Physalis minima Linn. Biotechnol Lett,2004, 26(7): 545–548.

[19]Qi XJ, Guo LK. Effects of exogenous phytohormones on hairy root of Scutellaria baicalensis and biomass baicalin. J Shaanxi Univ Sci Technol, 2009, 27(2): 48–50 (in Chinese).齊香君, 郭樂康. 外源激素對黃芩毛狀根生長及黃芩苷合成的影響. 陜西科技大學學報, 2009,27(2): 48–50.

[20]Gangopadhyay M, Dewanjee S, Bhattacharya S.Enhanced plumbagin production in elicited Plumbago indica hairy root cultures. J Biosci Bioeng, 2011, 111(6): 706–710.

[21]Kastell A, Smetanska I, Ulrichs C, et al. Effects of phytohormones and jasmonic acid on glucosinolate content in hairy root cultures of Sinapis alba and Brassica rapa. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169(2): 624–635.

[22]Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, et al.Reactive oxygen gene network of plants. Trends Plant Sci, 2004, 9(10): 490–498.

[23]Shi HP, Qi Y, Zhang Y, et al. Induction of cucumber hairy roots and effect of cytokinin 6-BA on its growth and morphology. Chin J Biotech,2006, 22(3): 514–520 (in Chinese).施和平, 齊瑩, 張悅, 等. 黃瓜毛狀根的誘導及細胞分裂素6-BA對其生長和形態(tài)的影響. 生物工程學報, 2006, 22(3): 514–520.

[24]Shen FF, Yu SX, Fan SL, et al. The relationship between hornone and membrance lipid peroxidation in cotton leaf during senescence. J Plant Physiol Mol Biol, 2003, 29(6): 589–592 (in Chinese).沈法富, 喻樹迅, 范術(shù)麗, 等. 棉花葉片衰老過程中激素和膜脂過氧化的關(guān)系. 植物生理與分子生物學學報, 2003, 29(6): 589–592.

[25]Coll NS, Epple P, Dangl JL. Programmed cell death in the plant immune system. Cell Death Differ, 2011, 18(8): 1247–1256.

[26]Kunikowska A, Byczkowska A, Doniak M, et al.Cytokinins resume: their signaling and role in programmed cell death in plants. Plant Cell Rep,2013, 32(6): 771–780.

[27]Xia QZ, Zhang MJ, Zhang XL. High concentration of cytokinin induces programmed cell death of cotton suspension cultures.Southwest China J Agri Sci, 2005, 18(5): 579–583(in Chinese).夏啟中, 張明菊, 張獻龍. 高濃度細胞分裂素誘導棉花懸浮細胞程序性死亡的發(fā)生. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2005, 18(5): 579–583.

[28]Carmi F, Terzi M, Michele R, et al. High levels of the cytokinin BAP induce PCD by accelerating senescence. Plant Sci, 2004, 4(166): 963–969.

[29]Ye ZH, Varner JE. Expression of an auxin- and cytokinin-regulated gene in cambial region in Zinnia. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(14):6539–6543.

[30]Crowell DN, Amasino RM. Induction of specific mRNAs in cultured soybean cells during cytokinin or auxin starvation. Plant Physiol, 1991, 95(3):711–715.

[31]Vescovi M, Riefler M, Gessuti M, et al.Programmed cell death induced by high levels of cytokinin in Arabidopsis cultured cells is mediated by the cytokinin receptor CRE1/AHK4.J Exp Bot, 2012, 63(7): 2825–2832.

[32]Dominov JA, Stenzler L, Lee S, et al. Cytokinins and auxins control the expression of a gene in Nicotiana plumbaginifolia cells by feedback regulation. Plant Cell, 1992, 4(4): 451–461.