張雪潔，張建華，張偉，郭潔，周旭宇

1 中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101

2 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230039

T-bet是T-box基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，于2000年被研究者發(fā)現(xiàn)，早期被認(rèn)為只表達于 T細胞內(nèi)[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，T-bet還廣泛表達于天然免疫系統(tǒng)及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的多種細胞之中。T-bet含530個氨基酸，包括一個由189個氨基酸組成的能與T盒DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，其功能十分廣泛而復(fù)雜。在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，T-bet對CD4+T細胞亞群的分化以及CD8+T細胞的功能維持均起重要作用。T-bet發(fā)揮功能的分子機制至今仍待進一步研究。

為研究T-bet的功能及其分子機制，本實驗構(gòu)建了含有小鼠T-bet基因Tbx21的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。該載體上含有Thy1.1報告基因，可與T-bet共同轉(zhuǎn)錄表達。Thy1.1表達于細胞表面，因此可以通過檢測 Thy1.1的表達方便地鑒定出表達T-bet的細胞。此外，本實驗還進一步證明了包裝的病毒可以感染小鼠T細胞，并且外源表達T-bet后，可進一步激活T-bet的靶基因Ifng[2]，從而引起γ干擾素 (IFN-γ)的表達。該方法可證明構(gòu)建的載體具有表達功能正常的小鼠T-bet的能力。通過構(gòu)建該載體，為在小鼠來源的細胞中進一步研究T-bet的功能與作用機制奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞株、載體及測序

實驗所用Tbx21基因敲除小鼠購于Taconic公司；Platinum-E逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞株為本實驗室保存；T-bet表達載體為本實驗室保存；pGEM-T載體購于 Promega公司；pMSCVIRES-Thy1.1載體購于Addgene；感受態(tài)DH5α為本實驗室自制；測序工作由 Invitrogen公司完成。

1.2 試劑與儀器

內(nèi)切酶、連接酶及PCR相關(guān)酶購于TaKaRa公司；Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑為Promega公司產(chǎn)品；Anti-CD8α、Anti-CD3、Anti-CD28為 BioLegend公司產(chǎn)品；流式抗體 Anti-CD4-APC、Anti-CD8α-PerCP、Anti-Thy1.1-FITC、Anti-IFN-γ-PE為eBioscience公司產(chǎn)品；使用儀器主要為流式細胞儀BD FACSCalibur，購于BD公司。

1.3 含有酶切位點的T-bet基因的克隆和連接

以 T-bet-GFP表達質(zhì)粒為模板，從 Tbx21 cDNA上游設(shè)計上游引物，引物5′端加入SalⅠ內(nèi)切酶酶切位點，從 Tbx21基因下游設(shè)計下游引物，3′端加入BglⅡ內(nèi)切酶酶切位點，擴增出帶有酶切位點及Kozak序列的Tbx21基因。膠回收后與 pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，用藍白斑篩選的方法初步篩選重組子。初步篩選陽性的重組子使用PCR及SalⅠ和BglⅡ雙酶切兩種方法進行鑒定，對兩種方法鑒定均為陽性的重組子進行測序。

1.4 pMSCV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

將上一步得到的經(jīng)測序帶有Tbx21基因的T載體使用 SalⅠ和 BglⅡ雙酶切，膠回收 1.6 kb片段。同時，pMSCV-IRES-Thy1.1載體亦使用SalⅠ和 BglⅡ進行酶切，酶切后同樣進行膠回收。SalⅠ和BglⅡ酶切位點均位于載體啟動子后及IRES序列之前，可使插入序列與報告基因同時表達。將酶切回收后的 Tbx21片段與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α。抗性篩選陽性克隆同樣使用PCR與SalⅠ和BglⅡ雙酶切兩種方法進行鑒定。

1.5 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝

提取所構(gòu)建的pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1質(zhì)粒以及pMSCV-IRES-Thy1.1質(zhì)粒，使用轉(zhuǎn)染試劑Fugene 6轉(zhuǎn)染Platinum-E逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系，轉(zhuǎn)染后孵育48 h收集上清液，即為病毒懸液。使用Thy1.1熒光抗體對細胞進行染色，流式細胞術(shù)檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞系

使用上述病毒懸液分別感染貼壁細胞系NIH-3T3和懸浮小鼠雜交瘤細胞系D9，48 h后使用Thy1.1熒光抗體染色，流式細胞術(shù)檢測感染效率。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染活化CD4+ T淋巴細胞

磁珠負(fù)選出CD4細胞，置于提前用CD3、CD28抗體包被好的24孔板中，加入200 U/mL的重組人IL-2，培養(yǎng)48 h后可供感染。

病毒懸液中加入終濃度為 8 μg/mL的聚凝胺，使用該病毒混合液重懸 T細胞后室溫條件下1 800 r/min離心45 min進行感染，而后置于培養(yǎng)箱孵育 4 h，將病毒液更換為加有重組人IL-2的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T細胞后T-bet表達檢測和功能鑒定

感染48 h后，T細胞先進行表面染色，固定后加入破膜劑破膜，然后使用T-bet和IFN-γ熒光抗體進行胞內(nèi)染色，染色完成后使用流式細胞術(shù)檢測感染效率以及T-bet和IFN-γ的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1載體的構(gòu)建

2.1.1 pGEM-T-Tbet載體的鑒定

將藍白斑篩選出再經(jīng)PCR鑒定正確的重組基因克隆，使用 SalⅠ和 BglⅡ進行酶切鑒定，其圖譜與原設(shè)計相同，包含1.6 kb的目的基因條帶及3 kb的載體條帶。對重組基因進行序列測定，使用 M13與 T7引物分別從插入位點兩端進行測序，并設(shè)計引物從Tbx21基因700 kb處進行測序，測序結(jié)果進行拼接后，與小鼠T-bet基因吻合，結(jié)果正確 (圖1A)。

2.1.2 pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1載體的鑒定

將PCR鑒定正確的克隆經(jīng)SalⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定，與原設(shè)計圖譜相同，包含1.6 kb的目的基因條帶及6 kb的載體條帶 (圖1B、C)。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝

使用構(gòu)建的pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系Platinum-E，并對細胞進行報告基因 Thy1.1的熒光抗體染色，從而利用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示報告基因 Thy1.1表達率超過80% (圖為84.4%)，表明所構(gòu)建載體可以高效轉(zhuǎn)染包裝細胞，并可同時轉(zhuǎn)錄表達目的基因及其報告基因，從而進行高效的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝(圖 2)。

圖1 pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的鑒定Fig. 1 Identification of pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 retroviral vector. (A)M: TiangenTM DNA marker Ⅳ; 1:pGEM-T-Tbet digested with SalⅠand BglⅡ. (B)M: TiangenTM DNA marker Ⅳ; 2: pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 digested with SalⅠand BglⅡ. (C)Map of pMSCV-IRES-Thy1.1 vector.

圖2 pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1轉(zhuǎn)染包裝細胞系Platinum-E的效率Fig. 2 Transfection efficiency of pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 transfected into Platinum-E. (A)Flow cytometry of untransfected Platinum-E cells (left)and cells transfected with pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 recombinant retroviral vector (right). (B)Histogram overlay of untransfected Platinum-E cells (dotted line)and cells transfected with pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 recombinant retroviral vector (solid line).

2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞系

使用重組病毒感染 NIH-3T3及懸浮雜交瘤細胞D9，以檢測重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染能力，對感染后細胞進行報告基因Thy1.1的熒光抗體染色，并利用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示所包裝的重組病毒可以成功感染貼壁細胞系及懸浮細胞系，并具有較好的感染效率。兩種細胞系的感染效率分別為 57.2%和 58.3%(圖 3A、B)。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染活化的CD4+ T細胞及其T-bet表達情況檢測

使用包裝的T-bet重組逆轉(zhuǎn)錄病毒及空重組病毒分別感染活化的T-bet敲除的CD4+T細胞，對T細胞進行報告基因Thy1.1和 T-bet的熒光抗體染色并使用流式細胞術(shù)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T-bet重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的細胞，Thy1.1陽性細胞中的T-bet表達明顯上升，證明包裝載體能夠有效地轉(zhuǎn)錄及表達目的基因和報告基因 (圖4)。

圖3 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH-3T3及D9細胞系的效率檢測Fig. 3 Infection efficiency of NIH-3T3 and D9 cell lines with recombinant retrovirus. (A)Flow cytometry histogram overlay of uninfected NIH-3T3 cells (dotted line)and NIH-3T3 cells infected with pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 recombinant retrovirus (solid line). (B)Flow cytometry histogram overlay of uninfected D9 cells (dotted line)and D9 cells infected with pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 recombinant retrovirus (solid line).

圖4 被重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的T-bet敲除CD4+T細胞可表達T-betFig. 4 Expression of T-bet in T-bet knock out CD4+ T cells after infection of recombinant retrovirus. Flow cytometry histogram overlay of Thy1.1 negative T cells (dotted line)and Thy1.1 positive T cells (solid line). (A):T-bet knock out CD4+ T cell infected with pMSCV-IRES-Thy1.1 recombinant retrovirus. (B): T-bet knock out CD4+T cell infected with pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 recombinant retrovirus.

2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所表達T-bet的功能鑒定

對感染后的T-bet敲除的CD4+T細胞進行胞內(nèi) IFN-γ熒光抗體染色，使用流式細胞術(shù)檢測。結(jié)果顯示，被T-bet重組病毒感染后的細胞，Thy1.1陽性細胞 IFN-γ的表達水平增強，高于未被感染的 Thy1.1陰性細胞和被不含 T-bet的空重組病毒感染的細胞，表明所構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達的T-bet可在小鼠細胞內(nèi)發(fā)揮自身轉(zhuǎn)錄因子功能，從而調(diào)控其下游靶基因的表達(圖 5A、B)。

3 討論

T-bet作為免疫系統(tǒng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，其功能多樣。早期研究發(fā)現(xiàn)T-bet在naive T細胞向Th1方向分化時具有重要的作用[1,3]。Th1細胞又稱為炎癥性T細胞，主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等細胞因子，在抗胞內(nèi)病原體 (病毒、細菌)的感染中發(fā)揮重要作用，并與細胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答相關(guān)。隨著對T-bet研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)T-bet亦廣泛的在其他一些 T細胞亞群中，以復(fù)雜的機制發(fā)揮著多種調(diào)控功能[4-5]，并對CD4+T細胞亞群的分化[6]以及CD8+T細胞的功能維持[7]均起重要作用。如T-bet可以促進naive T細胞向Th1細胞分化[8]，并抑制其向Th2[9]、Th17[10]等其他亞群的分化過程；同時，也可以通過與轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的相互相作用[11]而抑制 naive T向 Tfh細胞的分化過程[12]。T-bet同樣也可在調(diào)節(jié)性T細胞中表達，并對免疫反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[13]。此外，T-bet對CD8+T細胞發(fā)揮免疫效應(yīng)也起著重要作用[14]。近年的研究還發(fā)現(xiàn)，T-bet還表達于天然免疫系統(tǒng)及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的多種細胞之中，如T-bet在自然殺傷性細胞[15-17]以及天然淋巴樣細胞(ILCs)的形成中起著決定性作用[18-22]。因此，作為天然免疫與適應(yīng)性免疫的紐帶[23]，T-bet再次成為研究的熱點。

圖5 被重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后，T-bet敲除CD4+ T細胞的IFN-γ表達量顯著上調(diào)Fig. 5 Upregulation of IFN-γ expression in T-bet knockout CD4+ T cell after infection of recombinant retrovirus. (A)Flow cytometry of T-bet knock out CD4+T cells infected with empty recombinant retrovirus (left)and pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 recombinant retrovirus (right), respectively. (B)Proportion of IFN-γ positive cells among CD4+ T cells. Empty: T-bet knock out CD4+ T cells infected with empty recombinant retrovirus; T-bet: T-bet knock out CD4+ T cells infected with pMSCV-Tbet-IRES-Thy1.1 recombinant retrovirus; *P=0.0338 compared with Thy1.1 negative group.

在臨床研究中，對T-bet的研究同樣受到重視。目前，T-bet已被證明與病原體導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、哮喘、Ⅰ型糖尿病、克羅恩氏病以及其他一些自身免疫性疾病等均有重要聯(lián)系[24]。對T-bet功能及其分子機制的研究可為相關(guān)研究提供理論指導(dǎo)，具有重要的意義。

在以往對T-bet的研究中，國內(nèi)研究者先后構(gòu)建了 T-bet的真核表達載體[25]以及腺病毒載體[26]，但真核表達載體無法直接轉(zhuǎn)染動物細胞，腺病毒載體包裝體系較為復(fù)雜且重組效率較低，因此，構(gòu)建比較簡單的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體不失為良好的解決辦法。

本研究通過構(gòu)建T-bet逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可以在各種可增殖細胞中表達T-bet，解決了原代細胞或其他一些特殊細胞系不易轉(zhuǎn)染的問題。同時，由于T-bet的流式染色效果并不十分理想，而我們構(gòu)建的載體目的基因后含有IRES-Thy1.1序列，可以在表達T-bet的同時表達報告基因 Thy1.1，通過檢測細胞表面的Thy1.1表達情況即可方便地鑒定出外源性T-bet表達陽性的細胞。

此外，載體構(gòu)建通常都會使用免疫印跡技術(shù)或者流式細胞術(shù)直接檢測目的蛋白的方法在細胞系中進行表達驗證，但這種方法有一定的缺陷。首先，載體蛋白表達可能受到細胞種類的限制。其次，抗體結(jié)合是基于所表達蛋白的特定結(jié)構(gòu)域，這種驗證方法只能證明表達蛋白具有可被抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并無法鑒定其功能是否正常。尤其是在涉及到突變體載體構(gòu)建時，可能會出現(xiàn)突變體只影響抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域而并不影響特定功能的情況，反之，也可能存在突變體影響了蛋白功能但并不影響抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的情況。因此，在可以體現(xiàn)表達蛋白功能的原代細胞中對其相關(guān)功能進行檢測，能更好地判斷目的蛋白的表達與功能情況。本研究中，我們采用了一種新方法對構(gòu)建載體表達T-bet的功能進行了鑒定,可準(zhǔn)確顯示表達的目的基因T-bet是否具有正常功能。采用本實驗方法與免疫印跡法或者流式細胞術(shù)直接檢測目的蛋白的方法共同驗證載體，可以更好地對載體的蛋白表達情況進行確認(rèn)。

綜上，本實驗構(gòu)建了帶有報告基因的 T-bet重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并使用兩種方法驗證了所構(gòu)建的載體的目的基因表達情況。該載體可以方便地在各種細胞中表達小鼠T-bet，為進一步研究T-bet發(fā)揮功能的分子機制奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

[1]Szabo SJ, Kim ST, Costa GL, et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell, 2000, 100(6): 655–669.

[2]Lee DU, Avni O, Chen L, et al. A distal enhancer in the interferon-γ locus revealed by genome sequence comparison. J Biol Chem, 2004, 279(6):4802–4810.

[3]Oestreich KJ, Weinmann AS. Transcriptional mechanisms that regulate T helper 1 cell differentiation. Curr Opin Immunol, 2012, 24(2):191–195.

[4]Miller SA, Weinmann AS. Molecular mechanisms by which T-bet regulates T-helper cell commitment. Immunol Rev, 2010, 238: 233–246.

[5]Lewis MD, Miller SA, Miazgowicz MM, et al.T-bet's ability to regulate individual target genes requires the conserved T-box domain to recruit histone methyltransferase activity and a separate family member-specific transactivation domain.Mol Cell Biol, 2007, 27(24): 8510–8521.

[6]Oestreich KJ, Weinmann AS. T-bet employs diverse regulatory mechanisms to repress transcription. Trends Immunol, 2012, 33(2): 78–83.

[7]Kao C, Oestreich KJ, Paley MA, et al,Transcription factor T-bet represses expression of the inhibitory receptor PD-1 and sustains virusspecific CD8+ T cell responses during chronic infection. Nat Immunol, 2011, 12(7): 663–671.

[8]Szabo SJ, Sullivan BM, Stemmann C, et al, Distinct effects of T-bet in TH1 lineage commitment and IFN-gamma production in CD4 and CD8 T cells.Science, 2002, 295(5553): 338–342.

[9]Hwang ES, Szabo SJ, Schwartzberg PL, et al, T helper cell fate specified by kinase-mediated interaction of T-bet with GATA-3. Science, 2005,307(5708): 430–433.

[10]Lazarevic V, Chen X, Shim JH, et al. Transcription factor T-bet represses Th17 differentiation by preventing Runx1-mediated activation of the RORγt gene. Nat Immunol, 2011, 12(1): 96–104.

[11]Oestreich KJ, Huang AC, Weinmann AS. The lineage-defining factors T-bet and Bcl-6 collaborate to regulate Th1 gene expression patterns. J Exp Med, 2011, 208(5): 1001–1013.

[12]Johnston RJ, Poholek AC, DiToro D, et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.Science, 2009, 325(5943): 1006–1010.

[13]Koch MA, Glady's Tucker-Heard, Perdue NR, et al.The transcription factor T-bet controls regulatory T cell homeostasis and function during type 1 inflammation. Nat Immunol, 2009, 10(6): 595–602.

[14]Sullivan BM, Juedes A, Szabo SJ, et al.Antigen-driven effector CD8 T cell function regulated by T-bet. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(26): 15818–15823.

[15]Townsend MJ, Weinmann AS, Matsuda JL, et al.T-bet regulates the terminal maturation and homeostasis of NK and Vα14i NKT cells.Immunity, 2004, 20(4): 477–494.

[16]Daussy C, Faure F, Mayo K, et al. T-bet and Eomes instruct the development of two distinct natural killer cell lineages in the liver and in the bone marrow. J Exp Med, 2014, [Epub ahead of print].

[17]Gordon SM, Chaix J, Rupp LJ, et al. The transcription factors T-bet and eomes control key checkpoints of natural killer cell maturation.Immunity, 2012, 36(1): 55–67.

[18]Sciumé G, Hirahara K, Takahashi H, et al. Distinct requirements for T-bet in gut innate lymphoid cells.J Exp Med, 2012, 209(13): 2331–2338.

[19]Powell N, Walker AW, Stolarczyk E, et al. The transcription factor T-bet regulates intestinal inflammation mediated by interleukin-7 receptor+innate lymphoid cells. Immunity, 2012, 37(4):674–684.

[20]Maloy KJ, Uhlig HH. ILC1 populations join the border patrol. Immunity, 2013, 38(4): 630–632.

[21]Rankin LC, Groom JR, Chopin M. The transcription factor T-bet is essential for the development of NKp46+innate lymphocytes via the Notch pathway. Nat Immunol, 2013, 14(4):389–395.

[22]Hoyler T, Connor CA, Kiss EA. T-bet and Gata3 in controlling type 1 and type 2 immunity mediated by innate lymphoid cells. Curr Opin Immunol, 2013,25(2): 139–147.

[23]Lazarevic V, Glimcher LH, Lord GM. T-bet: a bridge between innate and daptive immunity. Nat Rev Immunol, 2013, 13(11): 777–789.

[24]Lazarevic V, Glimcher LH. T-bet in disease. Nat Immunol, 2011, 12(7): 597–606.

[25]Tan WP, Mai YG, Huang JL, et al. Construction of murine T-bet cDNA eukaryotic expression vectors.Guangdong Med J, 2005, 26(10): 1332–1335 (in Chinese).檀衛(wèi)平, 麥友剛, 黃嘉凌, 等. 小鼠T-bet基因真核表達載體的構(gòu)建. 廣東醫(yī)學(xué), 2005, 26(10):1332–1335.

[26]Tan WP, Huang JL, Liu RY, et al. Construction of murine T-bet cDNA recombinant Adenovirus vectors and its identification. J SUN Yet-san Univ: Med Sci,2004, 25(6): 546–548 (in Chinese).檀衛(wèi)平, 黃嘉凌, 劉然義, 等. 小鼠T-bet基因重組腺病毒載體的構(gòu)建. 中山大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)科學(xué)版, 2004, 25(6): 546–548.