柳躍，潘超美，賴珍珍，吳國(guó)裕，劉欣，肖斌

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣州510006)

廣東省科技廳社會(huì)發(fā)展面上項(xiàng)目(2008B080701030)；湛江市農(nóng)業(yè)局科技項(xiàng)目(2005D2050006))

*

潘超美，教授，研究方向：藥用植物資源的開發(fā)利用、種質(zhì)資源遺傳多樣性研究；

E-mail：pancm@gzucm.edu.cn

毛冬青組培苗壯苗生根與煉苗移栽技術(shù)研究△

柳躍，潘超美*，賴珍珍，吳國(guó)裕，劉欣，肖斌

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣州510006)

目的以前期誘導(dǎo)培養(yǎng)的毛冬青無(wú)菌組培苗為試材，進(jìn)行壯苗生根和煉苗移栽的試驗(yàn)研究。方法對(duì)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比進(jìn)行選擇，用正交設(shè)計(jì)法篩選出最適宜的壯苗生根培養(yǎng)基；對(duì)開蓋時(shí)間、水培時(shí)間、保留有效葉片數(shù)及不同基質(zhì)進(jìn)行考察，以篩選出最佳的煉苗移栽條件。結(jié)果適宜的壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1；開蓋煉苗和水培練苗最適宜時(shí)間為8 d，保留葉片10片以上成活率最高，最佳的煉苗移栽基質(zhì)為蛭石，成活率達(dá)87.50%。結(jié)論6-BA和NAA對(duì)壯苗有顯著影響，NAA效果強(qiáng)于6-BA，NAA對(duì)根的誘導(dǎo)有顯著意義；移栽成活的關(guān)鍵是適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行煉苗，蛭石良好的保水透氣性和保肥能力更適于毛冬青的移栽。

毛冬青；壯苗生根；煉苗移栽

毛冬青IlexpubescensHook.etArn.為冬青科常綠灌木,主要分布于長(zhǎng)江以南地區(qū)，為我國(guó)南方的常用中藥[1]。毛冬青以干燥根入藥，具有活血通絡(luò)、消腫止痛、清熱解毒之功效[2]。以毛冬青根提取物制成的注射液、膠囊和片劑常用于臨床上心血管疾病和各種炎癥的治療，近年來(lái)隨著毛冬青制劑需求量的增長(zhǎng)，原料藥材市場(chǎng)缺口較大。毛冬青藥材主要來(lái)源于野生資源，其種子萌發(fā)率低，扦插繁殖生根較困難。目前關(guān)于毛冬青組織培養(yǎng)方面的研究?jī)H見于賴珍珍等[3]發(fā)表的毛冬青的組織培養(yǎng)與快速繁殖的報(bào)道，本研究在其前期離體快繁叢芽成功的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出毛冬青壯苗生根所需的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑最佳配比，并探討煉苗馴化的適宜條件，以期為今后毛冬青優(yōu)質(zhì)種苗的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)以及野生轉(zhuǎn)家種馴化技術(shù)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本課題組前期以毛冬青種子無(wú)菌苗上胚軸離體快繁獲得的叢芽。

1.2 方法

毛冬青壯苗、生根培養(yǎng)分別以MS和1/2 MS為基本培養(yǎng)基，按表1和表2采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法添加不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。選取健壯、無(wú)菌的試管苗，剪成約1.5 cm帶莖節(jié)小苗，接種于不同配比的培養(yǎng)基中，在室溫25±2 ℃，光照強(qiáng)度40 μmol·m-2·s-1，光照周期12 h·d-1條件下培養(yǎng)60 d。培養(yǎng)60 d天后，取長(zhǎng)勢(shì)良好、根系發(fā)達(dá)、高為3～5 cm的組培苗進(jìn)行煉苗條件篩選，最后用蛭石、河沙、園土不同基質(zhì)按不同的比例進(jìn)行移栽煉苗。

表1 L9(34)壯苗試驗(yàn)因素水平表

表2 L9(34)生根試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)毛冬青叢芽壯苗生長(zhǎng)的影響

通過(guò)60 d的培養(yǎng)后，第5號(hào)6-BA 0.3 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1和第6號(hào)6-BA 0.3 mg·L-1+ NAA 0.75 mg·L-1激素組合上的試管苗長(zhǎng)勢(shì)最好，平均增高明顯，植株粗壯，葉片大而墨綠(圖1-A)。添加NAA可誘導(dǎo)植株長(zhǎng)出少量須根，根系短而纖細(xì)。6-BA濃度過(guò)高會(huì)抑制植株的生長(zhǎng)，當(dāng)6-BA濃度大于NAA濃度時(shí)，基部出現(xiàn)膨大的愈傷組織，并有側(cè)芽長(zhǎng)出。從直觀分析法(表3)可以得出，以苗增高為參考指標(biāo)，6-BA和NAA對(duì)毛冬青的壯苗均有重要影響，NAA影響作用大于6-BA，從均值可以得出6-BA最優(yōu)濃度水平為0.3 mg·L-1，NAA最優(yōu)濃度水平為0.75 mg·L-1。

表3 L9(34)壯苗正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

對(duì)正交結(jié)果方差分析(表4)顯示，NAA對(duì)毛冬青壯苗有顯著性差異(P<0.05)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為6-BA 0.3 mg·L-1與NAA 0.5 mg·L-1或NAA 0.75 mg·L-1時(shí)均能誘導(dǎo)出健壯的植株，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)的節(jié)約原則，以6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1更為合適。

表4 L9(34)壯苗方差分析

*差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)毛冬青試管苗生根的影響

將生長(zhǎng)至3～4個(gè)節(jié)帶葉的試管苗轉(zhuǎn)接到正交設(shè)計(jì)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的生根培養(yǎng)基上，1周后，基部根系開始生長(zhǎng)，60 d后均能形成須根系，說(shuō)明NAA和IBA的對(duì)毛冬青生根的誘導(dǎo)均有影響，從表5可見，以NAA影響效果最明顯。NAA濃度在0.2mg·L-1時(shí)最為適宜，可誘導(dǎo)出大量須根系，濃度過(guò)高則會(huì)抑制生根并且產(chǎn)生多數(shù)不正常的白色氣生根。當(dāng)NAA為0.2 mg·L-1，IBA為0.1 mg·L-1時(shí)平均生根數(shù)達(dá)37.8條，植株根系粗壯，生長(zhǎng)良好(圖1-B、1-C)。直觀分析法(表5)表明，在毛冬青生根誘導(dǎo)試驗(yàn)中，NAA對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大，IBA也有一定影響。均值越大，水平越優(yōu)，故NAA的第二個(gè)濃度水平0.2 mg·L-1為最優(yōu)，IBA的第三個(gè)濃度水平0.3 mg·L-1為最優(yōu)。

表5 L9(34)生根誘導(dǎo)正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

用方差分析法(表6)分析兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在生根試驗(yàn)中，NAA對(duì)毛冬青生根誘導(dǎo)具有顯著性差異(P<0.05)，IBA為0.1 mg·L-1時(shí)同樣能誘導(dǎo)健壯根系。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，生根最佳配方組合為NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1。

表6 L9(34)生根方差分析

*差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

A：壯苗培養(yǎng)60d后的生長(zhǎng)情況 B～C：生根培養(yǎng)60d后的生長(zhǎng)情況 D：移栽到蛭石的試管苗圖1 毛冬青壯苗生根與煉苗移栽

2.3 不同開蓋煉苗時(shí)間對(duì)毛冬青移栽成活率的影響

結(jié)果表明，開蓋煉苗8 d后，再進(jìn)行移栽，毛冬青移栽成活率最高(圖2)，此時(shí)葉片不易枯萎，整體生長(zhǎng)良好。未經(jīng)開蓋煉苗的毛冬青直接移植，成活率只有43.75%，組培苗死亡過(guò)半，移栽后葉片很快出現(xiàn)萎蔫。隨著開蓋煉苗時(shí)間的延長(zhǎng)，毛冬青組培苗的移栽成活率不斷提高，超過(guò)8 d成活率反而下降，選擇開蓋煉苗8 d為最佳的開蓋煉苗時(shí)間。

圖2 不同的開蓋煉苗時(shí)間對(duì)毛冬青成活率的影響

2.4 不同水培煉苗時(shí)間對(duì)毛冬青移栽成活率的影響

不同的水培時(shí)間對(duì)煉苗亦有一定的影響，它能讓移栽前的小苗快速適應(yīng)外界溫差濕度等變化，提高抗逆能力。從圖3可以看出，水培煉苗8 d后，再進(jìn)行移栽，毛冬青組培苗成活率最高，移栽30d后成活率達(dá)到87.50%，植株整體生長(zhǎng)狀況良好，為最佳水培煉苗時(shí)間。試驗(yàn)表明，煉苗前采用水培法進(jìn)行培養(yǎng)后移栽，成活率普遍提高，但隨著水培煉苗時(shí)間的延長(zhǎng)，毛冬青移栽成活率反而降低。

圖3 不同的水培煉苗時(shí)間對(duì)毛冬青成活率的影響

2.5 保留有效葉片數(shù)對(duì)毛冬青移栽成活率的影響

從圖4可以看出，移栽煉苗時(shí)保留葉片10片以上對(duì)毛冬青組培苗成活率最高，達(dá)到86.67%，整體生長(zhǎng)狀況最好，幼苗生長(zhǎng)快，葉色深綠，根系粗壯，有新根長(zhǎng)出。葉片低于10片以下時(shí)，幼苗光合作用能力弱，生長(zhǎng)緩慢，自養(yǎng)能力不完善，導(dǎo)致部分苗株死亡。綜合比較，煉苗時(shí)選擇10片以上葉片進(jìn)行移栽為最佳條件。

圖4 有效葉片數(shù)對(duì)毛冬青成活率的影響

2.6 不同移栽基質(zhì)對(duì)毛冬青移栽成活率的影響

移栽前的煉苗處理是為了提高植株移栽時(shí)適應(yīng)外界環(huán)境的能力，而移栽基質(zhì)則會(huì)直接影響組培苗的成活率和植株的生長(zhǎng)，也是組培苗過(guò)渡到大田定植的成活關(guān)鍵之一。在相同的培養(yǎng)條件下，1號(hào)基質(zhì)(蛭石∶河沙∶園土=1∶0∶0)上的組培苗成活率最高，達(dá)87.50%(表7)。幼苗根系密集，有較多新根長(zhǎng)出，苗生長(zhǎng)良好，葉片油亮墨綠(圖1-D)。7號(hào)和10號(hào)移載成活率較高，蛭石、河砂和園土按適當(dāng)?shù)谋壤M合可以提高基質(zhì)的保水保肥和透氣的能力，提高移栽成活率。4號(hào)、8號(hào)和10號(hào)成活率較高，但整體生長(zhǎng)狀況不及1號(hào)和7號(hào)。由此可見，當(dāng)蛭石在基質(zhì)中占有較大比例時(shí)，可以保證小苗成活率。 3號(hào)移栽成活率最低，呈線性下降，多數(shù)小苗因根部通氣不好發(fā)生腐爛枯死，少數(shù)存活苗株葉片短小，枯黃，這是由于園土雖然保濕性良好，但容易板結(jié)成塊，影響通氣。園土表面容易出現(xiàn)染菌現(xiàn)象，原因可能是春季煉苗濕度大，適合真菌生長(zhǎng)。基質(zhì)中摻有園土的5號(hào)、6號(hào)和9號(hào)基質(zhì)也出現(xiàn)表面染菌現(xiàn)象，多數(shù)幼苗莖基部發(fā)黑，最終枯死。單組分河沙基質(zhì)的2號(hào)移栽成活率亦較低，由于河沙的保濕性一般，導(dǎo)致植株長(zhǎng)勢(shì)矮小，葉片部分出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。

表7 不同移栽基質(zhì)配比對(duì)毛冬青每周成活率的影響

注：+表示苗生長(zhǎng)一般，++ 表示苗生長(zhǎng)較好，+++表示苗生長(zhǎng)很好。

3 討論

本試驗(yàn)考察了不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)毛冬青離體快繁壯苗和生根的影響，研究結(jié)果表明，單獨(dú)添加NAA時(shí)，在所使用的濃度范圍內(nèi)，植株的生長(zhǎng)與濃度呈正相關(guān)；NAA與適當(dāng)濃度的6-BA配合可以有效地促進(jìn)葉片的生長(zhǎng)，植株長(zhǎng)勢(shì)健壯，葉大色綠。6-BA濃度比例過(guò)高時(shí)，會(huì)抑制植物的頂端優(yōu)勢(shì)和葉的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)根的生長(zhǎng)也有抑制作用。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度以及配比均對(duì)植物器官形成有明顯的的調(diào)控作用。在壯苗試驗(yàn)中，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的濃度比不能大于1，否則會(huì)產(chǎn)生膨大的愈傷組織和叢生小芽，并抑制頂芽的生長(zhǎng)。在生根試驗(yàn)中，NAA和IBA都能誘導(dǎo)出健壯、發(fā)達(dá)的根系和長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，且NAA對(duì)生根的促進(jìn)效應(yīng)優(yōu)于IBA，這與同屬植物冬青在生根試驗(yàn)中得到的結(jié)果一致[5]。在毛冬青組培苗生產(chǎn)過(guò)程中，NAA對(duì)根的分化和增粗生長(zhǎng)均有明顯效果。

組培苗植株幼嫩柔弱，從恒定的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境過(guò)渡到變化的外界自然環(huán)境中，抗逆性差，所以移栽前需要對(duì)植株進(jìn)行不同的煉苗處理，以提高植株的保水能力和自養(yǎng)能力[6]。開蓋煉苗和水培煉苗處理，有利于誘導(dǎo)幼苗適應(yīng)外界環(huán)境的生長(zhǎng)能力。水培時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致根系細(xì)胞呼吸作用受到抑制，降低植株的成活率。保留一定的葉片數(shù)能提高毛冬青煉苗的成活率，有效葉片數(shù)10片以上植株光合作用能力較強(qiáng)，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要保證環(huán)境的濕度，以免葉片蒸騰作用過(guò)強(qiáng)而發(fā)生死亡。適宜的煉苗條件能夠大幅度提高毛冬青組培苗的移栽成活率，通過(guò)煉苗過(guò)程，可以促進(jìn)葉片保護(hù)組織分化、提高氣孔的閉合功能、使蒸騰作用降低，以適應(yīng)外界溫濕度的變化，這與前人相關(guān)的研究結(jié)果一致[7-11]。

煉苗基質(zhì)的種類是影響組培苗成活率的關(guān)鍵因素，3種基質(zhì)由于比重、結(jié)構(gòu)和孔隙度的不同，具有不同的保水性和透氣性。蛭石質(zhì)地疏松，具有良好的保濕性，透氣性和保肥能力，有助于根系細(xì)胞的呼吸和生長(zhǎng)，避免根系發(fā)生腐敗[12]，能有效地促進(jìn)毛冬青幼苗的根系發(fā)育。河沙其透氣性較好而保水性較差，容易造成基質(zhì)缺水。園土的透氣性弱，極易發(fā)生根系腐爛和植株萎蔫現(xiàn)象。

本試驗(yàn)建立了毛冬青的離體快繁技術(shù)，對(duì)毛冬青的壯苗生根及煉苗移栽的配方優(yōu)化和馴化條件具有一定的指導(dǎo)作用，對(duì)毛冬青種質(zhì)資源的可持續(xù)利用和日后組培苗的高效生產(chǎn)及大田育苗具有一定參考價(jià)值。

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TheStudyonRapidPropagationinVitroandTransplantTechniqueofIlexpubescens

LIUYue,PANChaoMei*,LAIZhenZhen,WUGuoYu,LIUXin,XIAOBin

(SchoolofChinesePharmaceuticalScience，GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006,China)

Objective：Rapid propagation in vitro and transplant technique ofIlexpubescenas were studied with aseptic seedlings.MethodsOrthogonal design method was used to investigate the effect of combinations of different plant growth regulartors on strengthening seedling and rooting ofIlexpubescen.The effect of duration of opening vessel lid,the length of hydroponic time,the number of remained leaves and different type of transplanting stromata on survival ratio of seedlings were appraised in order to screen out the best transplant conditions.ResultsThe results showed that the suitable phytohormonic medium for strengthening seedling was MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1,the fitting rooting medium was 1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1,The best time of opening vessel lid and the best hydroponic time were both 8 days,keeping more than 10 pieces of leaves could increase the survival rate,the best transplant stromata was vermiculite,whose survival rate was up to 87.50%.ConclusionThe research showed that both 6-BA and NAA had prominent effect on strengthening seedling,and the effect of NAA was greater than that of 6-BA.In addition,NAA revealed a better effect on the induction of rooting.The key to success of transplant was hardening of seedling.Vermiculite seemed to be more suitable for transplant due to its capacity of keeping moisture,gas permeability and fertilizer.

Ilexpubescens;Strengthen seedling and rooting;Transplant

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.012

2014-03-08)