馬園園，顏天華，程 濤，劉雯清，曹永兵，3＊（.中國藥科大學(xué)，南京 98；.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350；3.第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 00433）

我國衛(wèi)生部2008年公布的全國第三次死因調(diào)查報告顯示，惡性腫瘤已成為引起我國城鄉(xiāng)居民死亡的第二大因素，占死亡總數(shù)的22.32%，死于不同程度耐藥的腫瘤患者達(dá)90%以上。其中有67%的肝癌患者在用抗癌藥后很快產(chǎn)生腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR），MDR又是困擾惡性腫瘤臨床療效的主要因素［1－2］。引起 MDR的原因很多，包括P糖蛋白為主的藥物外排泵的高表達(dá)、腫瘤細(xì)胞凋亡通路功能下調(diào)、具有耐藥特性的腫瘤干細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境改變等［3］，目前P糖蛋白的過表達(dá)被認(rèn)為是引起腫瘤多藥耐藥的主要原因［4－5］。P糖蛋白是ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP依賴性轉(zhuǎn)運蛋白）超家族中的代表性成員之一［6］。人類的P糖蛋白由1 280個氨基酸組成包含2個高度一致的NH2氮端以及COOH碳端，由兩組610個氨基酸串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)組成，二者之間通過一個約60個氨基酸的linker相連接［7－8］。同時，該蛋白主要轉(zhuǎn)運疏水親脂性藥物，細(xì)胞膜脂質(zhì)能夠提供疏水的環(huán)境，其雙分子層的結(jié)構(gòu)決定了膜上蛋白的功能。研究表明，P糖蛋白是引起MDR的重要原因之一，P糖蛋白作為細(xì)胞膜上具有重要功能的轉(zhuǎn)運蛋白，它主要轉(zhuǎn)運疏水親脂性藥物，細(xì)胞膜脂質(zhì)能夠提供疏水的環(huán)境，這種雙分子層的物理化學(xué)的結(jié)構(gòu)決定了膜上蛋白的功能。同時P糖蛋白部分定位于脂筏區(qū)域內(nèi)，并且在該區(qū)發(fā)揮作用，其功能的調(diào)節(jié)與脂筏中鞘脂和膽固醇的改變有關(guān)［9］。因此，鞘脂和膽固醇的改變也可影響P糖蛋白的定位和轉(zhuǎn)運活性［10－11］，本文將對P糖蛋白與膜膽固醇、磷脂和糖脂的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)闡述。

1 P糖蛋白功能與細(xì)胞膜微區(qū)脂筏結(jié)構(gòu)組成的關(guān)系

細(xì)胞膜上的脂質(zhì)主要包括膽固醇、磷脂和糖脂，磷脂雙分子層構(gòu)成細(xì)胞膜的基本骨架，蛋白質(zhì)分子以覆蓋、貫穿、鑲嵌3種方式排布于膜上，糖類只存在于膜外，與蛋白質(zhì)分子結(jié)合在一起成為糖蛋白，與脂質(zhì)結(jié)合在一起成為糖脂。P糖蛋白屬于跨膜蛋白，在所有的膜蛋白中，P糖蛋白是對所處的脂質(zhì)環(huán)境最敏感的膜蛋白之一［9］。同時P糖蛋白與脂筏有著密切的關(guān)系，脂筏又是細(xì)胞膜上含有特殊脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的微區(qū)，富含膽固醇和鞘磷脂。研究脂筏的結(jié)構(gòu)是闡明脂筏作用分子機制的基礎(chǔ)，已知有許多參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子（包括脂類、酰基化蛋白及膜結(jié)合蛋白等）聚集在脂筏的內(nèi)層，它們在脂筏的定位分布是脂筏作為信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)平臺的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一［12－13］。最初根據(jù)三株多藥耐藥細(xì)胞（HT－29，MCF－7－ADR，BC－19）得出約24%～40%的P糖蛋白定位于脂筏區(qū)［2］，后來又有研究表明，細(xì)胞株和去污劑的種類都會影響P糖蛋白在脂筏區(qū)的定位，他們之間的關(guān)系如表1［14］所示。

表1 不同細(xì)胞、不同裂解方法提取的脂筏區(qū)P糖蛋白所占的比例Tab.1 Recapitulation of the various reported experimental findings of P－gp presence in membrane depending on cell type，caveolin expression，cell lysis technique

從表1可以看出，在部分細(xì)胞中用Trition X－100提取的脂筏中的P糖蛋白的含量小于Lubrol、Brij96和碳酸鹽緩沖液［14］。另外有文獻(xiàn)報道，40%的糖蛋白存在于脂筏區(qū)，也是這部分P糖蛋白來發(fā)揮其外排的功能［15－16］。因此，脂筏的形成使質(zhì)膜內(nèi)層參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的脂類分子在局部濃集，形成有利于P糖蛋白定位的微環(huán)境，這可能是脂筏參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制之一。

2 P糖蛋白功能與細(xì)胞膜膽固醇之間的關(guān)系

膽固醇是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要組成成分，它在細(xì)胞膜上主要的功能包括儲存能量、加速擴散作用、加速離子的通透、維持膜的流動性和參與蛋白質(zhì)的磷酸化。甲基β環(huán)糊精能夠耗竭膽固醇，并且能夠增加細(xì)胞膜的流動性，從而破壞細(xì)胞膜。有研究表明，細(xì)胞膜上分子的流動性對P糖蛋白的活性有一定的抑制作用［14］，甲基β環(huán)糊精與細(xì)胞共孵育后發(fā)現(xiàn)P糖蛋白的功能下降，即該蛋白的活性與膽固醇之間有一定的關(guān)系，加入環(huán)糊精后P糖蛋白功能的變化可能是由細(xì)胞膜流動性增加引起的［17］。同時加入環(huán)糊精后發(fā)現(xiàn)部分P糖蛋白由脂筏區(qū)轉(zhuǎn)移到非脂筏區(qū)［15］，因此P糖蛋白功能的變化也可能是由P糖蛋白由脂筏區(qū)轉(zhuǎn)移到非筏區(qū)引起的。

研究表明，細(xì)胞膜上膽固醇的組成也會影響P糖蛋白的表達(dá)，其中使用低密度脂蛋白和高密度脂蛋白來補充和消耗膽固醇時，分別上調(diào)和下調(diào)了人巨噬細(xì)胞P糖蛋白的表達(dá)［18］。另外在MDR1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，膽固醇能夠激活P糖蛋白ATP酶的活性，為了進(jìn)一步研究膽固醇對P糖蛋白ATP酶活性的影響，采用了蛋白增溶試劑CHAPS（3－［（3－膽固醇氨丙基）二甲基氨基］－1－丙磺酸），它是一種蛋白質(zhì)裂解液，能夠保護(hù)蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)，溶解膜蛋白，從而解除蛋白與蛋白質(zhì)間的相互作用。加入CHAPS獲得的P糖蛋白可以用來計算基礎(chǔ)ATP酶活性，結(jié)果顯示，對于膽固醇較少的Sf9昆蟲細(xì)胞膜，加入CHAPS后P糖蛋白ATP酶活性不增加，細(xì)胞裂解后加入皂苷隔絕膽固醇后，P糖蛋白ATP酶活性有所下降，這也進(jìn)一步說明膽固醇在維持P糖蛋白ATP酶活性中有重要的作用［19－20］。

另外，向Caco－2細(xì)胞中加入甲基β環(huán)糊精抑制了羅丹明的外排，這種現(xiàn)象伴隨著P糖蛋白轉(zhuǎn)移出富含膽固醇的區(qū)域［21］。其中羅丹明是一種膜電位敏感的親脂性陽離子熒光染料，可以自由進(jìn)入細(xì)胞，有較高的熒光量子產(chǎn)率，熒光較強，目前已成為常用的熒光探針物質(zhì)也是P糖蛋白的特異性底物，可通過檢測它在細(xì)胞內(nèi)的積聚情況和外排速度間接反映P糖蛋白的功能。同時在P糖蛋白高表達(dá)的表皮細(xì)胞中，膽固醇耗竭以后底物維拉帕米的吸收增加即P糖蛋白的功能有所下降［22］。最后，通過比較不同種類的多藥耐藥細(xì)胞對加入甲基β環(huán)糊精產(chǎn)生的效應(yīng)，得出P糖蛋白的功能依賴于細(xì)胞總膽固醇的含量［23－24］。

3 P糖蛋白功能與細(xì)胞膜磷脂的關(guān)系

細(xì)胞膜上的磷脂包括磷脂酰膽堿（PC）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰絲氨酸（PS）等，其中PC和SM分布于質(zhì)膜雙層的外層，而PE和PS分布于質(zhì)膜的內(nèi)層。脂筏部分主要磷脂組分為磷脂酰膽堿（PC）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰絲氨酸（PS），非脂筏質(zhì)膜部分為PC和PE，這說明SM和PS主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜的脂筏微域。研究表明，脂筏部分質(zhì)膜內(nèi)層的PE和PS含較多的短鏈脂肪酸或不對稱脂酰鏈，這可能是磷脂分子在脂筏內(nèi)側(cè)定位分布的重要因素。在細(xì)胞膜的脂筏微區(qū)，脂筏內(nèi)層磷脂（PE＋PS）的脂酰鏈與外層鞘脂的脂酰鏈相互交錯對插，脂筏內(nèi)外層之間通過疏水的脂酰鏈相互結(jié)合，形成穩(wěn)定的部分交錯對插的脂雙層，同時細(xì)胞膜多種磷脂組分也是參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子［25－26］。

P糖蛋白作為一個完整的膜蛋白，它的部分功能取決于所在的脂質(zhì)環(huán)境，文獻(xiàn)研究表明，一些磷脂可能是作為P糖蛋白的底物，從而調(diào)節(jié)蛋白在膜上的轉(zhuǎn)運活性［27］。另外也有報道說明鞘磷脂和葡萄糖神經(jīng)酰胺能夠參與P糖蛋白的轉(zhuǎn)運作用，因此P糖蛋白除了能夠轉(zhuǎn)運有毒外來物，還可以作為外轉(zhuǎn)酶參與細(xì)胞膜雙側(cè)脂質(zhì)環(huán)境的形成［28－29］。關(guān)于脂質(zhì)外轉(zhuǎn)酶的活性和P糖蛋白關(guān)系的研究最初是依據(jù)MDR1轉(zhuǎn)染的表皮細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照），檢測胞內(nèi)熒光值。結(jié)果表明：在排除了胞吐，向培養(yǎng)液中加入脂質(zhì)受體后，被標(biāo)記的短鏈鞘磷脂從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞外的交換增加［30－31］。通過檢測多藥耐藥CEM／VBL300細(xì)胞磷脂的熒光積累，發(fā)現(xiàn)這種發(fā)生轉(zhuǎn)換的脂質(zhì)包含許多極性的分子如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等，熒光值在細(xì)胞外熒光淬滅后依然存在，并且在加入P糖蛋白抑制劑后熒光值有所下降，說明磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺是P糖蛋白的底物［32］。相同的標(biāo)記的磷脂酰膽堿熒光實驗在KBV1and MCF／ADR細(xì)胞上也證實了這個問題，同時結(jié)果還顯示了磷脂酰膽堿的轉(zhuǎn)運效率低于羅丹明123，與多柔比星的效率相當(dāng)（羅丹明123和多柔比星都是P糖蛋白的底物）［33］。

4 P糖蛋白功能與細(xì)胞膜糖脂的關(guān)系

糖脂是含糖而不含磷酸的脂類，普遍存在于原核和真核細(xì)胞的質(zhì)膜上，其含量約占膜脂總量的5%以下，在神經(jīng)細(xì)胞膜上糖脂含量較高，約占5%～10%，糖脂也是兩性分子，其結(jié)構(gòu)與SM很相似，只是由一個或多個糖殘基代替了磷脂酰膽堿而與鞘氨醇的羥基結(jié)合。最簡單的糖脂是半乳糖腦苷脂，它只有一個半乳糖殘基作為極性頭部，在髓鞘的多層膜中含量豐富。變化最多、最復(fù)雜的糖脂是神經(jīng)節(jié)苷脂，其頭部包含一個或幾個唾液酸和糖的殘基，神經(jīng)節(jié)苷脂也是神經(jīng)元質(zhì)膜中具有特征性的成分。

考慮到糖脂是細(xì)胞膜的組成成分之一，也是脂筏重要的組成部分，就有一些報告研究其與P糖蛋白直接或間接的關(guān)系，通過檢測羅丹明123的外排和多柔比星對卵巢癌2780AD細(xì)胞的毒性來說明外源性加入一些神經(jīng)酰胺衍生物對該蛋白的直接影響，這項實驗顯示，只有中性的糖脂對P糖蛋白的外排功能起到促進(jìn)作用，表明糖脂的極性對P糖蛋白發(fā)揮作用有重要的影響。同時與敏感細(xì)胞相比，P糖蛋白高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞，葡萄糖神經(jīng)酰胺的含量增加［34］，研究表明，糖基化產(chǎn)物葡萄糖神經(jīng)酰胺的增加也存在于 MCF－7－AdrR，OVCAR－3和KB－V1耐藥細(xì)胞中，并且這種效應(yīng)可以通過許多多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑恢復(fù)［35］。下面以葡萄糖神經(jīng)酰胺為例來介紹兩者之間的影響：首先，不同濃度的葡萄糖神經(jīng)酰胺合成抑制劑影響也不同，30μmol·L－1的PDMP（葡萄糖神經(jīng)酰胺生物合成抑制劑）可以30%抑制HepG2細(xì)胞羅丹明的外排，而當(dāng)濃度小于15μmol·L－1沒有發(fā)現(xiàn)抑制作用［36］。其次，采用基因轉(zhuǎn)染或者反義引物的方法來控制葡萄糖神經(jīng)酰胺的表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)表達(dá)被激活時可以誘導(dǎo) MCF－7和 MCF－7／ADR耐藥性都增強，而在抑制其表達(dá)時，耐藥細(xì)胞敏感性增強得比較明顯［37］。為了進(jìn)一步研究，研究者又考察了PDMP對P糖蛋白的磷酸化的影響，結(jié)果表明PDMP能夠明顯抑制P糖蛋白的磷酸化，同時外源性地加入鞘糖脂GD3后P糖蛋白的磷酸化得到了恢復(fù)［38］，因此糖脂可能是通過調(diào)節(jié)P糖蛋白的磷酸化來改變其外排功能。

5 小結(jié)

膜脂質(zhì)主要由磷脂、膽固醇和少量糖脂構(gòu)成，在大多數(shù)細(xì)胞的膜脂質(zhì)中，磷脂占總量的70%以上，膽固醇不超過30%，糖脂不超過10%。磷脂中含量最多的是磷脂酰膽堿，其次是磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺，含量最少的是磷脂酰肌醇。磷脂、膽固醇和糖脂都是雙嗜性分子，磷脂分子中的磷酸和堿基、膽固醇分子中的羥基以及糖脂分子中的糖鏈等親水性基團(tuán)分別形成各自分子中的親水端，分子的另一端則是疏水的脂肪酸烴鏈，這些分子以脂質(zhì)雙層的形式存在于質(zhì)膜中，親水端朝向細(xì)胞外液或胞質(zhì)，疏水的脂肪酸烴鏈則彼此相對，形成膜內(nèi)部的疏水區(qū)。膜脂質(zhì)雙層中的脂質(zhì)構(gòu)成是不對稱的，含氨基酸的磷脂（磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇）主要分布在膜的近胞質(zhì)的內(nèi)層，而大部分的磷脂酰膽堿和全部糖脂都分布在膜的外層。在所有的膜蛋白中，P糖蛋白作為一種重要的膜蛋白，是對所處的脂質(zhì)環(huán)境最敏感的膜蛋白之一［9］。該蛋白與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)環(huán)境有著密不可分的關(guān)系，膜脂質(zhì)的變化影響該蛋白的定位，從而影響該蛋白的活性。P糖蛋白也會作為一種外轉(zhuǎn)運酶影響脂質(zhì)的合成［30］，同時P糖蛋白的過表達(dá)被認(rèn)為是引起腫瘤多藥耐藥的主要原因［8－9］，因此明確細(xì)胞膜脂質(zhì)和P糖蛋白的關(guān)系，能為找到耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供強有力的幫助。

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