楊躍民 高 偉 武 鵬 張 軍 王 磊 王 蕾

（1.邯鄲出入境檢驗檢疫局 河北邯鄲 056000；2.晨光生物科技集團股份有限公司）

1 前言

孔雀石綠是有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，既是染料也是殺菌劑，具有潛在的致突變、致畸和致癌作用，并且在特定的條件下會轉(zhuǎn)化為毒性更強的隱形孔雀石綠?？兹甘G常用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，因其在水產(chǎn)品及環(huán)境中殘留時間長，并有三致危險性而被大量研究和關(guān)注，中國、美國、加拿大以及歐盟等許多國家和地區(qū)均已禁止將其作為人類食用魚的獸藥使用[1]。但是由于孔雀石綠是常用的三苯甲烷類工業(yè)染料，被廣泛應(yīng)用于紡織印染、油墨、涂料中[2,3]，食品包裝材料上的噴印或手寫油墨會因其具有的遷移和滲透特性[4-6]而直接污染食品，或在食品再加工中混入造成食品交叉污染[7]。因此，建立食品包裝材料中孔雀石綠的分析方法，間接評估其對食品交叉污染的影響具有現(xiàn)實意義。

目前，孔雀石綠的測定方法主要有理化檢測和免疫學(xué)檢測兩種[8]。在理化檢測法中以高效靈敏的高效液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)檢測法兩種方法為主，主要檢測的樣品有水、水產(chǎn)品和飼料[9-12]。本研究利用凝膠滲透色譜柱凈化食品包裝材料，采用高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)進行檢測，建立一種簡單、快速測定孔雀石綠和隱性孔雀石綠的新方法，為評估食品包裝材料中非法染料對食品交叉污染提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗樣品

市場采購用于裝食品的塑料帶字和圖案包裝物（直接噴?。┖脱b農(nóng)產(chǎn)品用麻袋和尼龍袋（含記號筆、水印筆等手寫油墨痕跡）。

2.1.2 試劑

甲醇、乙腈、甲酸、異丙醇：色譜純，F(xiàn)isher；乙酸乙酯、環(huán)己烷：分析純，天津大茂；乙酸銨：優(yōu)級純，天津大茂；孔雀石綠草酸鹽、隱性孔雀石綠氯化物：Dr. Ehrenstorfer；超純水：美國Millipore超純水器制得。

2.1.3 儀器

超高效液相色譜儀：Waters Acquity BEH C18色譜柱，二元溶劑管理系統(tǒng)，自動進樣系統(tǒng)；三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters，電噴霧電離源、MassLynx V4.1軟件；全自動凝膠滲透色譜儀：GPC，美國J2 Preplinc；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申生R201BL；TH-600超聲波清洗儀：濟寧天華；分析天平：感量0.0001 g，島津AUY220。

2.2 方法

2.2.1 標(biāo)樣配制

準(zhǔn)確稱取孔雀石綠及隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品各50.0 mg（按其標(biāo)示含量折算）轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，加乙腈定容，得到濃度約為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于冰箱中-18℃避光保存。使用前，取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量配制孔雀石綠和隱性孔雀石綠濃度均為2.0mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈溶液稀釋為0.2、2、4、8、10 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.2.2 凝膠色譜凈化方法建立

量取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液置于250mL旋蒸瓶中，濃縮至干。用乙酸乙酯：環(huán)己烷（V/V，1:1）稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至約10 mg/L濃度，在GPC以進樣體積 5 mL，流速 4.7 mL/min進行處理，獲得含孔雀石綠和隱性孔雀石綠凈化樣品的收集時間為 28-42 min。

2.2.3 樣品制備及凈化

將樣品中的油墨印刷部分剪碎（碎片直徑在1mm以下），稱取5 g 置于100 mL具塞三角瓶內(nèi)，加入乙酸乙酯：環(huán)己烷（V/V，1:3.5），振蕩30 min，超聲10 min；將抽濾后的萃取液旋轉(zhuǎn)蒸干，用乙酸乙酯：環(huán)己烷（V/V，1:1）定容至25 mL容量瓶中，搖勻，用0.45μm的濾膜過濾至小試管內(nèi)，過GPC凈化，在28-42 min內(nèi)收集樣品；將收集液濃縮蒸干，加入2 mL乙腈，超聲溶解，過0.22 μm有機濾膜，轉(zhuǎn)入質(zhì)譜小瓶待測。

2.2.4 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源 ( ESI )；掃描模式：正離子掃描( ESI+)；檢測模式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；錐孔電壓：3.0 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：420℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h。離子對情況見表1，用外標(biāo)法定量。

表1 MRM 掃描模式參數(shù)

2.2.5 液相色譜條件

色譜柱：Waters Acquity BEH C18 (2.1×50 mm，1.7 μm)；柱溫：35℃；樣品室溫度：23-25℃；流速：0.350 mL/min；進樣量：7 μL。梯度洗脫采用流動相A和B按表2方法操作，流動相A為水:甲酸:乙酸銨=200:0.2:0.077 (v:v:m)，流動相B為乙腈:乙酸銨=200:0.077 (v: m)。

表2 梯度洗脫條件

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測色譜圖

按照確定的樣品處理方法和儀器參數(shù)條件進行標(biāo)樣和麻袋樣品的測定，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 隱性孔雀石綠和孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品MRM色譜圖

圖2 麻袋樣品中隱性孔雀石綠和孔雀石綠MRM色譜圖

3.2 樣品提取與凈化

目前，孔雀石綠及隱性孔雀石綠的檢測方法大都存在提取和凈化步驟復(fù)雜，使用試劑有毒等缺點[9-12]。本研究選用的乙酸乙酯和環(huán)己烷混合液不僅可以提取水溶性的孔雀石綠還可以同時提取脂溶性的隱性孔雀石綠。此外，包裝材料中的油墨為大分子有機化合物[13,14]，若直接提取不僅基體干擾大，而且損耗儀器。因此，本研究選用凝膠滲透色譜凈化，可以最大限度地排除提取液中油墨基體干擾[15]，這樣不僅簡化了操作步驟，而且經(jīng)過凝膠滲透色譜處理過的待測樣品稀釋倍數(shù)少，使質(zhì)譜檢測靈敏度和準(zhǔn)確度明顯提高。標(biāo)樣和麻袋樣品中的孔雀石綠及隱性孔雀石綠圖譜見圖3和圖4。

圖3 孔雀石綠和隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品在254nm下的GPC色譜圖

圖4 麻袋樣品在254nm下的GPC色譜圖

由圖譜可以看出，使用凝膠色譜凈化可以較好地實現(xiàn)孔雀石綠和隱性孔雀石綠與樣品中雜質(zhì)成分的分離。

3.3 色譜條件

流動相中加入乙酸銨不僅可以提高待測物的離子化效率，而且作為流動相的緩沖液可以穩(wěn)定孔雀石綠在C18柱上的保留時間，乙腈可調(diào)節(jié)隱性孔雀石綠的分離度。經(jīng)過多次調(diào)試不同流動相比例，最終在表2條件下可較好地分離目標(biāo)物。

3.4 線性關(guān)系和定量限

將配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液在最佳條件下進行測定，并用各分析物定量離子對的峰面積對其質(zhì)量濃度進行作圖。峰面積與孔雀石綠和隱性孔雀石綠的質(zhì)量濃度在0.1μg/kg-5.1μg/kg和0.1μg/kg-3.9μg/kg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為：y=5145x-105，y=11925x+183；相關(guān)系數(shù)r分別為0.9991和0.9989，以10倍信噪比計算定量限均為0.6μg/kg。

3.5 加標(biāo)回收率和精密度

以無油墨圖文的陰性麻袋樣品為空白測試樣品, 稱取樣品后進行加標(biāo)，加標(biāo)水平分別為0.5、1.0、2.0μg/kg，按照2.2.3步驟進行凈化處理，在相同的條件下每個水平做7個平行樣，所得到的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3 。

表3 回收率和精密度（n=7）

結(jié)果表明，該方法的檢測準(zhǔn)確性和精密度均良好，可以滿足檢測要求。

3.6 實際樣品檢測結(jié)果與分析

應(yīng)用上述方法，對12份市場采購的帶有油墨或用油墨標(biāo)記的食品塑料包裝袋、麻袋、農(nóng)產(chǎn)品包裝袋（尼龍袋）中油墨部分進行測定，結(jié)果見表4。

表4 實際樣品測定結(jié)果（n=3）

檢測結(jié)果表明：食品包裝材料上的油墨大部分含有孔雀石綠和隱性孔雀石綠，并且含量較高。進一步分析發(fā)現(xiàn)包裝袋上直接噴印文字圖文的不含孔雀石綠和隱性孔雀石綠，而包裝袋上有手寫油墨標(biāo)記的農(nóng)產(chǎn)品包裝袋均含有孔雀石綠，大部分含有隱性孔雀石綠。并且有3個樣品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠均＞1 mg/kg。

4 結(jié)論

（1）本研究建立了凝膠滲透色譜凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定食品包裝材料中孔雀石綠及隱性孔雀石綠含量的方法，該方法減少了基質(zhì)效應(yīng)的影響, 測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠, 加標(biāo)回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性好；定量限均為0.6μg/kg，可以滿足檢測要求。

（2）將該方法應(yīng)用于實際包裝材料檢測，結(jié)果表明：有噴印圖文的食品包裝不含孔雀石綠和隱性孔雀石綠，有手寫油墨標(biāo)記的包裝袋上均含有孔雀石綠，大部分含有隱性孔雀石綠，并且有的含量較高，>1mg/kg，可見在農(nóng)產(chǎn)品加工過程中可能存在包裝材料交叉污染的情況。為保證食品安全，建議食品避免接觸食品包裝袋上的油墨；農(nóng)產(chǎn)品加工時要避免帶有手寫油墨的包裝袋污染產(chǎn)品，防止再加工食品產(chǎn)生交叉污染。

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