李曉君，楊雪飛，朱皖南，羅建平*

(1. 合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.寧國(guó)市金達(dá)生物科技有限公司，安徽 寧國(guó) 242300)

中藥農(nóng)業(yè)

安徽省自然科學(xué)基金(00041508)

*

羅建平，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中草藥與功能食品；Tel：13095518428，E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn

蛇足石杉莖尖組織培養(yǎng)研究△

李曉君1，楊雪飛1，朱皖南2，羅建平1*

(1. 合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.寧國(guó)市金達(dá)生物科技有限公司，安徽 寧國(guó) 242300)

目的研究蛇足石杉莖尖組織培養(yǎng)條件，建立組織快繁體系。方法通過(guò)添加不同濃度的蔗糖及植物激素改良基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察其對(duì)蛇足石杉莖尖誘導(dǎo)叢生芽和GGB(綠色小體)，GGB的分化以及叢生芽生根的影響。結(jié)果誘導(dǎo)莖尖發(fā)生叢生芽和GGB的最適宜培養(yǎng)基分別為MS+2%蔗糖和MS+4%蔗糖；將GGB轉(zhuǎn)接在MS+2%蔗糖培養(yǎng)基中，平均每團(tuán)GGB可分化出16株叢生芽；在改良MS+10 μmol·L-1IBA生根培養(yǎng)基中，全部叢生芽再生健壯的根系，再生植株的移栽成活率可達(dá)80%。HPLC檢測(cè)表明，組織快繁的蛇足石杉植株具有石杉?jí)A甲合成能力，其含量為607.40±30.75 μg·g-1，與野生植株相當(dāng)。結(jié)論初步建立蛇足石杉組織快繁體系，擴(kuò)大了蛇足石杉種質(zhì)資源，并為石杉?jí)A甲的合成途徑提供了研究基礎(chǔ)。

蛇足石杉；莖尖；組織培養(yǎng)；GGB；叢生芽

蛇足石杉Huperziaserrata(Thunb.)Trev屬石杉科石杉屬，又名千層塔，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴珍稀中藥材，其有效成分石杉?jí)A甲(huperzine A)是一種低毒、高效、可逆且具有高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，臨床上用于治療重癥肌無(wú)力、老年癡呆癥和精神分裂癥等[1-2]。但蛇足石杉野生植株生境特殊，生長(zhǎng)緩慢，加之開(kāi)采過(guò)度，面臨資源枯竭的危機(jī)[3]。

近年來(lái)，許多單位對(duì)扦插繁殖、芽孢繁殖和組織快繁再生蛇足石杉藥用資源展開(kāi)了探索研究[4-6]。在組織快繁方面，由于內(nèi)生真菌的存在，早期的研究集中在外植體滅菌方法的篩選[7]，近年相繼有蛇足石杉孢子萌發(fā)[8]、莖尖培養(yǎng)[9]、愈傷組織誘導(dǎo)[10]的報(bào)道，但尚未建立一套可行的由外植體到完整植株的再生體系。本文對(duì)蛇足石杉莖尖培養(yǎng)快繁植株的技術(shù)體系進(jìn)行了研究，以期為再生蛇足石杉種質(zhì)資源及實(shí)現(xiàn)人工規(guī)?；耘嗵峁┗A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料蛇足石杉Huperziaserrata(Thunb.)Trev采自安徽省九華山，由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)顧月華教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 外植體的滅菌與培養(yǎng) 切取蛇足石杉孢子體莖尖(1.5～2.0 cm)，按前文方法[7]進(jìn)行表面滅菌。滅菌后的莖尖接種到MS培養(yǎng)基(附加2%蔗糖、6.0 g·L-1瓊脂)上，置于25 ℃、光照時(shí)間12 h·d-1、光照強(qiáng)度2 000 lx環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 叢生芽和綠色小體(green globular body，GGB)的誘導(dǎo) 切取長(zhǎng)約5～8 mm新生頂芽接種至含不同蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基上，每組接種30個(gè)芽，重復(fù)3次。培養(yǎng)3個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)叢生芽和GGB的誘導(dǎo)率。

1.2.3 GGB的增殖和叢生芽分化 將GGB轉(zhuǎn)至附加2%蔗糖、6.0 g·L-1瓊脂的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3個(gè)月，統(tǒng)計(jì)GGB的增殖和叢生芽分化。

1.2.4 生根培養(yǎng)和移栽 分離叢生芽，并轉(zhuǎn)至附加不同濃度IBA的改良MS(1/4標(biāo)準(zhǔn)MS礦質(zhì)元素+1/2標(biāo)準(zhǔn)MS有機(jī)成分)和B5培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)2個(gè)月，觀察記錄其對(duì)幼芽生根的影響。所有生根培養(yǎng)基中均添加2%蔗糖、6.0 g·L-1瓊脂。挑選生根良好的完整植株，經(jīng)1～2 d煉苗后轉(zhuǎn)入栽培基質(zhì)(碎樹(shù)皮1∶泥炭土3∶珍珠巖1)中進(jìn)行移栽。

1.2.5 石杉?jí)A甲含量檢測(cè) 分別取蛇足石杉野生植株(春季)和莖尖再生植株(培養(yǎng)5個(gè)月)莖葉于60 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)20目篩，取20 mg粉末按邵浩等[11]的方法提取石杉?jí)A甲。提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。HPLC色譜柱：Merck PurospherR C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(80∶20)；流速：0.5 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：308 nm，柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的生長(zhǎng)

野生蛇足石杉莖尖外植體經(jīng)表面滅菌后，在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后，將無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3個(gè)月后約60%莖尖頂芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)約5～8 mm，部分莖尖分叉生長(zhǎng)形成2個(gè)新芽(見(jiàn)圖1-A)。

A：莖尖頂芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng) B：頂芽誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽 C：頂芽誘導(dǎo)形成GGB(右上角為GGB掃描電鏡圖) D：GGB增殖分化叢生芽 E：叢生芽生根 F：移栽圖1 蛇足石杉莖尖快繁植株過(guò)程

2.2 莖尖新芽誘導(dǎo)再生叢生芽和GGB

將莖尖外植體上的新生頂芽接種至附加不同激素的MS培養(yǎng)基上，芽可以緩慢生長(zhǎng)，但無(wú)叢生芽和GGB出現(xiàn)。轉(zhuǎn)移到基本MS培養(yǎng)基中，可見(jiàn)叢生芽和GGB的發(fā)生，它們的誘導(dǎo)形成受培養(yǎng)基中蔗糖濃度的調(diào)節(jié)(見(jiàn)表1)。當(dāng)蔗糖濃度為1%時(shí)，芽全部白化死亡，提高蔗糖濃度，芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，并在基部產(chǎn)生叢生不定芽(見(jiàn)圖1-B)。在2%蔗糖時(shí)，所有轉(zhuǎn)接的新芽均發(fā)生叢生不定芽。當(dāng)蔗糖濃度為2～4%時(shí)，轉(zhuǎn)接的新芽在頂端和基部均出現(xiàn)GGB，GGB的發(fā)生率依蔗糖濃度提高而提高，低濃度時(shí)以頂端GGB為主，高濃度時(shí)以基部GGB為主(見(jiàn)圖1-C)。

表1 MS培養(yǎng)基中蔗糖濃度對(duì)莖尖新芽誘導(dǎo)叢生芽和GGB的影響

注：不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著，P<0.05(表2同)。

2.3 GGB再生叢生芽

將新誘導(dǎo)產(chǎn)生的GGB轉(zhuǎn)接至基本MS培養(yǎng)基，2周后可見(jiàn)GGB顏色由暗淡的深綠色逐漸變成有光澤的亮綠色，4周后GGB體積開(kāi)始明顯增殖，培養(yǎng)至3個(gè)月，GGB可增殖4～6倍。GGB在增殖的同時(shí)，其表面開(kāi)始分化形成叢生芽(見(jiàn)圖1-D)，3個(gè)月后，平均每團(tuán)GGB可分化形成16個(gè)叢生芽。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：(1)基本培養(yǎng)基中添加激素會(huì)抑制GGB增殖和叢生芽分化；(2)分化的GGB在切除叢生芽后可繼續(xù)增殖并分化出新的叢生芽；(3)若將GGB切割成小塊后接種至新鮮培養(yǎng)基，GGB未見(jiàn)增殖并逐漸褐化死亡。

2.4 植株再生和移栽

將生長(zhǎng)至1 cm高的叢生苗分離后接種至含不同濃度IBA的MS和B5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)根的再生(見(jiàn)表2)。表2的數(shù)據(jù)表明，在基本培養(yǎng)基中，MS比B5更有利于叢生苗根的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)；在改良MS培養(yǎng)基中添加IBA可顯著影響根的生長(zhǎng)，對(duì)根生長(zhǎng)最適合的濃度是10 μmol·L-1，此時(shí)根白色、健壯，植株生長(zhǎng)旺盛(見(jiàn)圖1-E)。將生根的完整植株經(jīng)煉苗后移栽至栽培基質(zhì)中，覆膜保濕2周后去膜，大約4～5周后多數(shù)植株頂端開(kāi)始生長(zhǎng)，2個(gè)月后移栽成活率約為80%(見(jiàn)圖1-F)。

表2 不同濃度的IBA和培養(yǎng)基對(duì)叢生芽生根的影響

2.5 再生植株中石杉?jí)A甲測(cè)定

HPLC分析顯示(見(jiàn)圖2)，組培快繁植株和野生植株均出現(xiàn)和石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的洗脫峰，表明蛇足石杉莖尖經(jīng)叢生芽途徑或經(jīng)GGB分化叢生芽途徑再生的植株具有合成石杉?jí)A甲的能力，且合成能力與野生蛇足石杉相當(dāng)，其中4月份野生蛇足石杉的石杉?jí)A甲含量為512.92±60.86 μg·g-1，生長(zhǎng)5個(gè)月的快繁植株中石杉?jí)A甲含量為607.40±30.75 μg·g-1。

A：石杉?jí)A甲標(biāo)品 B：野生蛇足石杉 C：快繁植株圖2 石杉?jí)A甲HPLC圖

3 討論

在蛇足石杉組織培養(yǎng)的研究中，Wojciech等[6]篩選出外植體存活并可生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基，沈曉霞等[7]通過(guò)莖尖誘導(dǎo)出愈傷組織，包日雙等[8]通過(guò)野生孢子誘導(dǎo)出原葉體并進(jìn)行了再分化研究，但這些研究均未建立起蛇足石杉組織培養(yǎng)快繁體系。本研究發(fā)現(xiàn)蛇足石杉莖尖在適宜的條件下可以通過(guò)兩種途徑再生植株：一是莖尖直接分化出叢生苗再生植株；二是莖尖先脫分化形成GGB，再由GGB再分化出叢生苗再生植株。

GGB是蕨類植物形態(tài)發(fā)生中出現(xiàn)的一種特有結(jié)構(gòu)，可以分化出新的植株，是許多蕨類植物組織快繁的必經(jīng)階段[12-14]，但在蛇足石杉組織培養(yǎng)中還是首次發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)研究中，培養(yǎng)基中的蔗糖濃度對(duì)GGB的發(fā)生有一定的影響，一定范圍內(nèi)蔗糖濃度越高，GGB的發(fā)生率越高，分析可能是GGB的發(fā)生需要較多的碳源進(jìn)行前期物質(zhì)積累。當(dāng)改良MS培養(yǎng)基中附加的蔗糖濃度為4%時(shí)，其GGB誘導(dǎo)率可達(dá)20%。GGB經(jīng)整體分離后繼續(xù)培養(yǎng)，能夠增殖分化形成叢生苗，平均每個(gè)GGB分化出16個(gè)叢生芽，繁殖系數(shù)較高。另外，在叢生苗生根研究中發(fā)現(xiàn)基本MS培養(yǎng)基相對(duì)于B5培養(yǎng)基更適宜生根，且激素IBA對(duì)根的生長(zhǎng)有顯著性的影響，較高或較低濃度的IBA均不利于叢生苗生根，在添加10 μmol·L-1IBA的MS培養(yǎng)基中叢生苗生根狀態(tài)最佳。

本實(shí)驗(yàn)初步建立了GGB→叢生苗→完整植株的組織快繁體系，為高效快繁蛇足石杉奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)，該快繁體系再生的蛇足石杉植株具有野生植株同樣的石杉?jí)A甲合成能力，也為解析石杉?jí)A甲的生物合成途徑提供了一種研究方式。

[1] 張君誠(chéng)，邢建宏，宋育紅，等.藥用植物蛇足石杉研究新進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源，2008，27(2)：1-5.

[2] 余紅英，孫遠(yuǎn)明.草藥蛇足石杉的研究進(jìn)展[J].中草藥，2001，32(3)：279-281.

[3] 梁昊，潘利華，羅建平.石杉?jí)A甲資源可持續(xù)利用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(23)：12467-12468.

[4] 盛束軍，徐建中，王志安，等.千層塔扦插繁殖研究[J].資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng)，2000，16(5)：268-269.

[5] Ma X Q，Gang D R.In vitro production of huperzine A，a promising drug candidate for Alzheimer’s disease[J].Phytochemistry，2008，69(10)：2022-2028.

[6] Wojciech S，Agnieszka P，Piotr S，et al.Somatic embryogenesis and in vitro culture of Huperzia selago shoots as a potential source of huperzine A[J].Plant Sci，2005，168(6)：1443-1452.

[7] 沈曉霞，俞旭平，盛束軍.千層塔莖尖組織培養(yǎng)滅菌方法的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27(6)：458-459.

[8] 包日雙，尹培培，郭斌，等.蛇足石杉原葉體的培養(yǎng)及孢子體的誘導(dǎo)[J].植物生理學(xué)，2012，48(4)：393-396.

[9] 楊雪飛，羅建平，王瑛.蛇足石杉莖尖滅菌方法與組織培養(yǎng)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(12)：4947-4948.

[10] 孫玉強(qiáng)，童建新，阮松林.千層塔組織培養(yǎng)中的外植體愈傷組織研究[J].杭州農(nóng)業(yè)科技，2008，(4)：10-12.

[11] 邵浩，張麗，呂會(huì)芳，等.HPLC測(cè)定九龍山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)石杉科4種植物石杉?jí)A甲的含量[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，23(6)：67-69.

[12] 韓德偉，關(guān)麗霞，王振龍.鐵線蕨孢子組織培養(yǎng)與快速繁殖研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(29)：16162-16162.

[13] 張光飛，蘇文華.狹翅巢蕨的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊，2002，38(2)：144.

[14] 張光飛，蘇文華.水鱉蕨幼葉的離體快速繁殖[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24(3)：234-236.

PlantRegenerationofHuperziaserratabyRapidPropagationofShootTips

LIXiaojun1，YANGXuefei1，ZHUWannan2，LUOJianping1*

(1.ShoolofBiotechnologyandFoodEngineering，HeFeiUniversityofTechnology，Hefei230009，China；2.NingguoJindaBiologicalTechnologyCo.，Ltd，Ningguo242300，China)

Objective：Factors influencing rapid propagation ofHuperziaserratashoot tips was investigated to establish an efficient system for its plant regeneration.MethodsThe basal medium was supplemented with different concentrations of sucrose and plant growth regulators.The induction of multiple shoots and green globular bodies(GGBs)，the differentiation of GGBs as well as the rooting of multiple shoots was determined.ResultsOn the basal MS medium supplemented with 2% sucrose，all shoot tip explants could be effectively induced to differentiate multiple shoots.On the basal MS medium supplemented with 4% sucrose，approximately 20% shoot tip explants were induced to produce GGBs.When GGBs were transferred onto the basal MS medium supplemented with 2% sucrose，the average 16 multiple shoots per GGB could be obtained.On the modified MS medium supplemented with 10 μmol·L-1IBA，all multiple shoots regenerated strong roots and the transplanting survival rate of whole plants might reach 80%.The HPLC assay showed that the regenerated plants ofH.serrataby rapid propagation had the ability to synthesize huperzine A and the content of huperzine A was 607.40±30.75 μg·g-1，which was near to that of wild plants.ConclusionThe efficient rapid propagation technique was established to provide a foundation for the sustained utilization ofH.serratagermplasm resources and the analysis of the biosynthesis pathway of huperzine A.

Huperziaserrata；Shoot tips；Tissue culture；GGB；Multiple shoots

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.010

2013-10-27)