陳燕，姜迪，張飛，陳隨清

(河南中醫(yī)學院，河南 鄭州 450046)

十二五國家科技支撐計劃(2011BAI06B02)；名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設—地黃全國生產(chǎn)區(qū)劃研究(20603020222)

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陳隨清，教授，研究方向：中藥品種整理與質(zhì)量標準研究；Tel：(0371)65676686，E-mail：suiqingchen@sohu.com

溫9302地黃塊根中化學成分動態(tài)積累規(guī)律研究△

陳燕，姜迪，張飛，陳隨清*

(河南中醫(yī)學院，河南 鄭州 450046)

目的研究地黃塊根在生長過程中主要化學成分的動態(tài)積累規(guī)律。方法采用HPLC法、RP-HPLC-RID法、硫酸-苯酚法分別對地黃中梓醇和毛蕊花糖苷、單寡糖、多糖進行含量測定；采用氨基酸自動分析儀測定地黃中氨基酸含量；采用SPSS軟件對各成分進行主成分分析。結(jié)果地黃塊根中梓醇含量呈上升趨勢；毛蕊花糖苷、葡萄糖、棉籽糖含量呈逐漸降低趨勢；多糖、蔗糖、水蘇糖、氨基酸含量呈曲線變化；水浸物含量總體變化不大。結(jié)論地黃塊根中各化學成分含量均在11月初達到較高值，此時期最宜采收，與傳統(tǒng)地黃采收期相吻合。

地黃；化學成分；動態(tài)積累；主成分分析

地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch的塊根。在我國有悠久的藥用歷史。近年來對地黃的研究主要集中在其化學成分[1-3]、藥理作用、組織結(jié)構(gòu)[4]等方面。我們對地黃藥材的化學成分動態(tài)積累規(guī)律進行了研究，溫9302地黃品種為近幾年河南懷地黃產(chǎn)區(qū)發(fā)展的主流品種，對其基礎研究較少，有關其生長過程中主要化學成分動態(tài)積累規(guī)律的研究甚少。本研究測定了溫9302地黃塊根在一個生長周期內(nèi)不同化學成分含量的變化，同時對各成分進行主成分分析，為地黃藥材的質(zhì)量評價及適宜采收期的確定提供科學依據(jù)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

溫9302地黃樣品采自河南省溫縣，經(jīng)河南中醫(yī)學院生藥學科陳隨清教授鑒定為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch的塊根。用于含量測定的樣品為新鮮地黃塊根，切片，60°烘干；用于顯微觀測的樣品為新鮮地黃塊根，切0.5～0.6cm小段，用F.A.A固定液(70%乙醇∶冰醋酸∶40%甲醛=90∶5∶5)固定。

1.2 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀(2998紫外檢測器，2414示差折光檢測器)；島津UV-2600紫外可見分光光度計；對照品梓醇(中國食品藥品檢定研究所，批號110808-201009，含量測定用)、毛蕊花糖苷(中國食品藥品檢定研究所，批號111530-200706，含量測定用)、葡萄糖(中國食品藥品檢定研究所，批號110833-200503，含量測定用)、蔗糖(中國食品藥品檢定研究所，批號111507-200302，含量測定用)、水蘇糖、(天津一方科技有限公司，批號BBT0176，含量測定用)、棉籽糖(天津一方科技有限公司，批號BBT0177，含量測定用)；甲醇、乙醇均為色譜醇(Fisher Scientific，4L)，雙蒸水。

2 方法和結(jié)果

2.1 地黃化學成分的測定

2.1.1 梓醇、毛蕊花糖苷、水溶性浸出物的含量測定 根據(jù)2010年版《中國藥典》相關項進行。對梓醇、毛蕊花糖苷含量測定進行了方法學考察，包括穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度以及加樣回收率等試驗，結(jié)果均符合含量測定要求，測定結(jié)果見表1，兩種成分的對照品HPLC圖譜見圖1、圖3，樣品圖譜見圖2、圖4。

圖1 梓醇標準品HPLC色譜圖

圖2 梓醇樣品HPLC色譜圖

圖3 毛蕊花糖苷對照品HPLC色譜圖

圖4 毛蕊花糖苷樣品HPLC色譜圖

2.1.2 多糖的含量測定 取地黃粉末0.1 g置于具塞錐形瓶中，加95%乙醇溶液50 mL，震蕩2 h，取出過濾，再加80%乙醇溶液50 mL，震蕩2小時，取出過濾，濾渣晾干，加50 mL蒸餾水，放置水浴鍋中溫浸3 h。取出過濾，取續(xù)濾液3 mL置10 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度即得供試品溶液。取制備好的供試品溶液2 mL，置10 mL的具塞試管中，加5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，加濃硫酸5 mL，靜置5分鐘，水浴加熱15 min，取出冷卻至室溫，紫外可見分光光度法測定其吸光度。對試驗的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度以及加樣回收率進行了研究，結(jié)果均符合含量測定要求。含量測定結(jié)果見表1。

2.1.3 單、寡糖的含量測定 采用高效液相色譜法同時對葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水蘇糖進行含量測定。對試驗的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度以及加樣回收率進行了研究，結(jié)果均符合含量測定要求。

色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX-NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶水=70∶30；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL。對照品及樣品HPLC色譜圖見圖5、圖6。

精密稱定樣品粉末1.5 g，置具塞錐形瓶中，加水50 mL，稱定重量，100℃水浴2 h，放冷，再稱定重量，用雙蒸水補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，用等量石油醚、乙酸乙酯依次萃取兩次，0.22 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測定含量。含量測定結(jié)果見表1。

A.葡萄糖 B.蔗糖 C.棉籽糖 D.水蘇糖圖5 混合標準品

圖6 地黃樣品單、寡糖色譜圖

2.1.4 氨基酸的含量測定 采用氨基酸自動分析儀按GB/T5009.124-2003測定。

精密稱取地黃藥材粉末0.1 g，置水解管內(nèi)，加6 mol·L-1鹽酸10 mL。加新蒸餾苯酚3滴，再將水解管放入冰中，冷凍5 min，抽真空(接近0 Pa)后充入氮氣，重復3次。將水解管放入恒溫干燥箱，110 ℃水解22 h，取出冷卻至室溫濾過，取續(xù)濾液1 mL于5 mL容量瓶內(nèi)，雙蒸水定容。在真空干燥箱50 ℃干燥，殘留物用雙蒸水水解，再干燥，反復進行兩次，用1 mL PH 2.2緩沖液溶解，供儀器測定用。將混合氨基酸標準品用pH 2.2緩沖液配成濃度為0.1 nmol·μL-1，用氨基酸自動分析儀測定。測定結(jié)果見表1。

表1 不同時期地黃塊根中化學成分含量測定結(jié)果

3 結(jié)果分析

3.1 不同時期地黃塊根多個化學成分含量比較

由表1中各成分含量測定結(jié)果可以看出，在一年的生長過程中，地黃塊根中梓醇含量呈上升趨勢，并在10月至11月基本穩(wěn)定在一個較高水平；地黃中毛蕊花糖苷的含量呈下降趨勢，在地黃生長初期含量較高，至10月中旬含量開始降低，在11月維持在較低水平；地黃中除總多糖外，單糖葡萄糖、寡糖中的蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量也比較高。測定結(jié)果表明，地黃塊根中多糖含量在一個生長周期內(nèi)呈折線變化，在10月中旬地上部分開始枯萎時，含量逐漸升高，至11月初達到較高值，然后下降至一個較低水平；葡萄糖含量呈逐漸降低趨勢，在地黃生長初期含量較高，進入10月后含量開始降低，至10月中旬降至最低，并穩(wěn)定在一個較低水平；寡糖中蔗糖的含量也呈折線變化，在11月初達到最大值；寡糖中棉籽糖的含量較低，在5%以下，含量呈逐漸降低趨勢；寡糖中水蘇糖的含量最大，進入10月后地黃塊根中水蘇糖的含量有一個先升高再降低的變化，但含量變化不大；總氨基酸含量呈折線變化，在10月中旬地上部分開始枯萎后，維持在一個較高水平。另外，地黃塊根中水溶性浸出物的含量總體變化不大，含量基本維持在一個水平。

3.2 不同時期主成分分析

主成分分析是多元統(tǒng)計中的一種資料挖掘技術。它在不丟失主要變量信息的前提下選擇為數(shù)較少的新變量來代替原來較多的變量，以排除眾多化學信息共存中相互重迭的信息。為更加準確的對地黃質(zhì)量作出評價，本研究利用主成分分析，將9個單一成分指標綜合成為3個綜合指標，根據(jù)3個綜合指標的貢獻率求出其相應隸屬函數(shù)值，并根據(jù)各綜合指標的相對重要性進行加權，得到一個生長周期內(nèi)地黃質(zhì)量的綜合評價值，結(jié)果見表2。綜合評價結(jié)果表明：地黃在第6時期綜合評價排名最高，即在11月初，地黃質(zhì)量評價最好，最宜采收。

表2 地黃塊根中9個成分累積貢獻率

由上表可知，當?shù)攸S85-5主成分個數(shù)為3時，累計貢獻率已經(jīng)有了85.5%，所以主成分個數(shù)取3個即可，則其對應的特征向量為：

Y1=-0.362X1+0.003X2-0.404X3+0.245X4+0.256X5+0.345X6+0.373X7-0.428X8-0.372X9

Y2=0.367X1-0.439X2-0.327X3+0.407X4-0.291X5+0.376X6-0.352X7-0.116X8+0.192X9

Y3=0.254X1+0.476X2+0.06X3+0.117X4+0.56X5+0.189X6-0.149X7-0.275X8+0.495X9

即：W=0.532482Y1+0.315386Y2+0.152132Y3

由表1中的數(shù)據(jù)，可計算出Y1，Y2，Y3，同時可計算出W，從而得出綜合評價結(jié)果，排名見表3。

表3 地黃塊根7個時期的綜合評價結(jié)果及排名

4 討論

地黃塊根不同生長時期，化學成分含量明顯不同。地黃生長初期梓醇含量較低，至10月中旬地上部分開始枯萎后，梓醇含量迅速增高，并在11月保持較高水平。李建軍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，地黃總糖在塊根中的分布比較廣，有可能集中于韌皮部和木質(zhì)部的輸導組織中。王太霞等[6]研究發(fā)現(xiàn)懷地黃塊根有效成分的含量高峰與其產(chǎn)量高峰一致，均在11月初時；本研究結(jié)果表明地黃塊根在11月初期，各成分含量均達到較高水平，與傳統(tǒng)采收期相符合。綜上所述，中藥采收期不僅決定中藥材的外觀形態(tài)，而且直接影響中藥材的化學成分和藥效，適宜的采收期是確保中藥材質(zhì)量穩(wěn)定可靠的前提和基礎。本研究表明地黃傳統(tǒng)采收期具有一定的科學性及可行性。

[1] 邱建國，張汝學，賈正平，等.HPLC測定不同產(chǎn)地生地黃中地黃寡糖和梓醇的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16(17)：110-113.

[2] 李曉琳，王敏，劉紅彥.地道產(chǎn)區(qū)地黃不同品種間多糖量的比較[J].中草藥，2008，39(8)：1251-1253.

[3] 李建軍，王瑩，陳小潔，等.不同產(chǎn)區(qū)地黃產(chǎn)量及指標成分的HPLC測定[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報，2011，45(4)：387-390.

[4] 劉孟奇，王小巧，陳隨清，等.地黃的組織化學研究[J].中藥材，2013，36(11)：1771-1773

[5] 李建軍，孫華，王太霞，等.懷地黃不同品種塊根顯微結(jié)構(gòu)與糖分含量的比較研究[J].河南大學學報，2007，37(5)：505-508.

[6] 王太霞，李景原，胡正海.懷地黃營養(yǎng)器官中梓醇的積累動態(tài)[J].中草藥，2004，35(2)：208-209.

CorrelativeAnalysisBetweenChangeRegularityofChemicalCompositionandOrganizationalStructureinRehmanniaglutinosaLibosch

CHENYan，JIANGDi，ZHANGFei，CHENSuiqing

(HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450046，China)

Objective：To study the changes of chemical composition in the roots ofRehmanniaglutinosaduring its growth process.MethodsDetermined the content of catalpol verbascoside，single oligosaccharides and polysaccharides in the roots ofR.glutinosaby HPLC，RP-HPLC-RID and sulfuric acid-phenol method.Use automatic amino acid analyzer to determine the content of amino acid in the roots ofR.glutinosa.Use SPSS to do Principal component analysis.ResultsIn the roots ofR.glutinosa，the content of catalpol is on upward trend；the content of verbascoside，glucose and raffinose is on a downward trend；the content of polysaccharide，sucrose，stachyose and amino acid is a line change；the content of water-soluble extractives is a little change.ConclusionThe content of chemical composition in the roots ofR.glutinosawas higher in early November，it is the good time to harvest，it was coincided with the traditional harvest of the roots ofR.glutinosa.

Rehmanniaglutinosa；Chemical composition；Dynamic accumulation；The principal components analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.012

2013-12-02)