左起亮，張 怡，姚江武

(廈門市口腔醫(yī)院修復(fù)科，福建廈門 361003)

飲茶可導(dǎo)致牙齒表面色素沉積并形成色漬，嚴重影響牙齒美觀。目前對于牙面色漬的清除主要以機械和化學(xué)方法為主，但這兩種方法均可不同程度地導(dǎo)致牙面受損。因此，探索生物酶技術(shù)清除牙面污垢的方法日益受到人們的關(guān)注。有研究顯示，巰基蛋白酶(cysteine proteases，CPs)能降解唾液膜和蛋白質(zhì)色漬［1］，但其對蛋白質(zhì)色漬的形成是否有預(yù)防作用，目前尚未見相關(guān)報道。本實驗采用與唾液富脯蛋白(proline-rich proteins，PRPs)結(jié)構(gòu)相近似的去磷酸化牛β-酪蛋白(dephosphorylated bovine β-casein，D β-CN)作為蛋白質(zhì)模型，以來自茶湯中的茶黃素(theaflavin，TF)作為色素模型［2］，并將Dβ-CN/TF復(fù)合膜構(gòu)筑在消散因子石英微天平(quartz crystal microbalance with dissipation，QCM-D)的芯片表面［3］;分別用3種 CPs對其進行水解后，測量殘余膜厚度及其再吸附TF的質(zhì)量，考察CPs水解對殘余蛋白質(zhì)/色素復(fù)合膜再吸附色素能力的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

QCM-D、5MHz金石英晶體芯片(Z500，KSV，芬蘭);純度≥98%的TF(Woko，日本);λ-pp蛋白磷酸酶(NEB，英國);Dβ-CN、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶(Sigma Aldrich，美國);蛋白磷酸化水平試劑盒和蛋白金屬磷酸酶(Thermo，美國);其他試劑如無特別說明均為分析純。實驗用水為Milli-Q超純水(電阻值18.2 Ω)。

1.2 方法

1.2.1 酶的激活及其活力測定

參照 Vasconcellos等［4］的方法，用5 mmol/L半胱氨酸鹽酸鹽和2 mmol/L EDTA分別對木瓜、菠蘿、無花果蛋白酶進行激活，并測量其酶活性。

1.2.2 Dβ-CN 的制備

30℃條件下，于每10 μmol/L的 Dβ-CN)中加入 50 units λ-PPase、1 × 1 mmol/L MnCl2、1 × 蛋白金屬磷酸酶(PMP)反應(yīng)緩沖液，水浴30 min后即制得 Dβ-CN［5］。

1.2.3 Dβ-CN 單層膜和 Dβ-CN/TF 復(fù)合膜的水解以及TF再吸附的觀察

通過自組裝將Dβ-CN固定到QCM-D金芯片表面(步驟詳見參考文獻［6］)，建立Dβ-CN單層膜;并在此基礎(chǔ)上，將12 μmol/L TF溶液以5 μL/s的流速注入QCM-D樣品池，建立Dβ-CN/TF復(fù)合膜。待吸附曲線平穩(wěn)后，將木瓜、菠蘿、無花果3種CPs溶液分別注入Dβ-CN單層膜和Dβ-CN/TF復(fù)合膜的表面，對其進行水解;待頻率波動達穩(wěn)態(tài)后，注入12 μmol/L TF溶液;當頻率再次達穩(wěn)定時，采用3倍頻歸一化法和分析軟件(KSV instruments version 3.11)分別記錄和計算Dβ-CN單層膜和殘余膜的厚度值及其吸附的TF質(zhì)量。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均數(shù)。實驗溫度為30℃，緩沖體系為離子強度0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鈉鹽緩沖液。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3 種 CPs酶活力

木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶經(jīng)激活后，其酶活力單位分別為(118.6 ±4.4)unit/mg、(67.3 ±3.6)unit/mg、(139.9 ±5.0)unit/mg。

2.2 水解前后膜厚度和質(zhì)量的變化曲線

在QCM-D芯片表面注入Dβ-CN后，吸附曲線迅速上升，120 min時達到穩(wěn)態(tài)，表明已形成Dβ-CN單層膜，設(shè)其厚度為h0;當在此基礎(chǔ)上注入TF時，吸附曲線再次上升，約80 min趨于平穩(wěn)，注入PBS后曲線走勢亦無明顯變化，表明已成功建立了穩(wěn)定的Dβ-CN/TF復(fù)合膜，并得出該膜吸附的TF質(zhì)量(m0)(圖1a)。在Dβ-CN/TF復(fù)合膜表面分別注入木瓜、菠蘿、無花果3種CPs后，其質(zhì)量和厚度均在20 min內(nèi)迅速下降;計算達到穩(wěn)態(tài)時的殘余復(fù)合膜的厚度(h1)后，注入TF溶液，曲線又有所上升，表明吸附有少量TF(m1)(圖1b)。在Dβ-CN單模表面注入CPs上述3種CPs后，其質(zhì)量和厚度的變化趨勢與Dβ-CN/TF復(fù)合膜相似;計算殘余單層膜的厚度并將其設(shè)為h2，然后注入TF溶液，并得到TF吸附質(zhì)量(m2)(圖1c)。

圖1 TF吸附于Dβ-CN)單層膜(a)、殘余復(fù)合膜(b)和殘余單層膜(c)的質(zhì)量與厚度伴隨時間變化曲線

2.3 3種CPs水解后膜厚度及其吸附TF質(zhì)量的比較

Dβ-CN)單膜和Dβ-CN)/TF復(fù)合膜經(jīng)木瓜、菠蘿、無花果3種CPs水解后，其厚度均明顯下降，其中以Dβ-CN單模下降最明顯，即:ho＞h1＞h2，兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);水解后殘余膜吸附TF的質(zhì)量隨著膜厚度的下降而減少，即:m0＞m1＞m2，兩兩相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);3種酶水解引起的β-CN/TF復(fù)合膜和殘余單層膜厚度及TF吸附質(zhì)量變化均為無花果蛋白酶＞木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶(P＜0.05);而木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)(表 1)。

表1 CPs水解前后膜的厚度及其吸附TF質(zhì)量的比較()

表1 CPs水解前后膜的厚度及其吸附TF質(zhì)量的比較()

字母(橫向比)和星號(縱向比)相同者P ＞0.05，不同者 P ＜0.05

酶膜厚度(nm)吸附TF質(zhì)量(ng/cm2)h0 h1 h2m0 m1 m2木瓜蛋白酶 9.4±0.1a 7.2 ±0.0b* 4.9±0.1c* 99±3a 26±1b* 17±1c*菠蘿蛋白酶 9.4±0.1a 7.2 ±0.1b* 5.1±0.1c* 99±3a 27±1b* 18±2c*無花果蛋白酶 9.4±0.1a 6.0±0.0b＊＊ 4.0±0.1c＊＊ 99±3a 17±1b＊＊ 11±1c＊＊

2.4 膜厚度與其吸附TF質(zhì)量的關(guān)系

根據(jù)最小二乘法原理，采用非線性回歸法［7］對數(shù)據(jù)進行擬合并得擬合曲線(圖2)。由圖可見膜的厚度與其吸附TF的質(zhì)量呈非淺性正相關(guān)。膜的厚度在4～7 nm時，TF的吸附質(zhì)量隨著膜厚度的增加而緩慢增長;當膜厚度＞7 nm時，TF吸附質(zhì)量的升幅明顯加大。

圖2 TF吸附質(zhì)量與膜厚度關(guān)系的擬合曲線

3 討論

唾液富含富脯蛋白(PRPs)，在其形成唾液膜后仍保留有能與多酚類物質(zhì)發(fā)生強力結(jié)合的特性，從而易導(dǎo)致牙面形成蛋白質(zhì)色漬。由于唾液中的PRPs純化困難，而 Dβ-CN與PRPs在結(jié)構(gòu)上有較多的相似點(高含量的脯氨酸、無規(guī)卷曲為主體的二級結(jié)構(gòu)以及通過聚乙烯–聚吡咯烷酮環(huán)結(jié)合多酚色素等)［2］，故本實驗以來源廣泛且純度較高的Dβ-CN)替代PRPs用于建立體外蛋白質(zhì)/色素復(fù)合模型。

有研究認為，當Dβ-CN固定于芯片表面后，N端位于基底層，富含脯氨酸的C端位于表層［8］，蛋白質(zhì)中大量無規(guī)卷曲的二級結(jié)構(gòu)可使較多脯氨酸中的酚式結(jié)構(gòu)充分暴露于溶液環(huán)境中［9］，并形成疏水袋，從而有利于分子間氫鍵的形成。當注入TF時，TF中的9個酚式羥基以及苯環(huán)結(jié)構(gòu)能促使TF與Dβ-CN發(fā)生氫鍵結(jié)合和疏水性結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的Dβ-CN/TF復(fù)合膜。其中，Dβ-CN的親水性N端可能具有酶降解的作用，而疏水性C端則擁有大量酶水解位點［3］;因此，當CPs作用于Dβ-CN/TF復(fù)合膜或Dβ-CN單層膜時，C端中富含的非極性氨基酸和芳香L-氨基酸的肽段就會被酶降解，從而導(dǎo)致疏水腔崩解，并使結(jié)合于C端的TF脫落，膜的質(zhì)量和厚度也會隨之下降。此時，由于肽鏈上可形成氫鍵的位點明顯減少，TF只能依靠彼此間的堆垛來增加質(zhì)量，并再附著于殘余膜表面;但這種結(jié)合力較弱，極易被沖洗掉，故殘余膜表面TF的吸附質(zhì)量明顯低于水解前的Dβ-CN單層膜。另外，在Dβ-CN)中，由于脯氨酸的數(shù)量分布從C端到N端逐漸減少，經(jīng)CPs水解后，會使大量脯氨酸散失而導(dǎo)致TF吸附量驟減［10］;此時的Dβ-CN/TF復(fù)合膜和Dβ-CN單層膜表面則會從疏水性轉(zhuǎn)化成親水性，不僅減少了Dβ-CN上的TF結(jié)合位點，還限制了TF吸附的疏水驅(qū)動力作用［11］。在本實驗所用的3種CPs中，以無花果蛋白酶水解后的殘余復(fù)合膜和殘余單層膜最薄，其再吸附TF的量也最少。此外，Dβ-CN/TF復(fù)合膜經(jīng)3種CPs水解后形成的殘余膜厚度值均較Dβ-CN單層膜大，再吸附TF的量也較大;這可能是由于TF在一定程度上抑制了CPs的活性，從而使與TF緊密結(jié)合的脯氨酸避開了酶的降解，并成為TF再次吸附的重要位點。

采用非線性回歸法擬合曲線對膜厚度與TF吸附質(zhì)量之間的關(guān)系進行分析顯示，當膜厚度小于7 nm時，TF的吸附質(zhì)量隨著膜的厚度增加而緩慢增加;當膜厚度大于7 nm時，TF的吸附質(zhì)量與膜厚度關(guān)系曲線呈陡峭上升趨勢。提示TF的結(jié)合位點和特有的松散結(jié)構(gòu)主要集中于大于7 nm的膜的表層［9］，即 Dβ-CN 的 C 端。

綜上所述，Dβ-CN/TF復(fù)合膜和Dβ-CN)單層膜經(jīng)巰基蛋白酶水解后，其殘余膜再吸附TF的能力明顯下降，提示巰基蛋白酶水解具有抑制色素再吸附的作用。

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