張 萍，李 誠(chéng)，余 波

(1.安康市中心醫(yī)院口腔科，陜西安康 725000;2.神木縣醫(yī)院口腔科，陜西榆林 719300)

人牙髓細(xì)胞是一種從牙髓組織中分離得到的細(xì)胞群，具有繁殖分裂和多分化的潛能，能分化為成牙質(zhì)樣細(xì)胞并形成牙本質(zhì)/牙髓樣的結(jié)構(gòu)［1－2］。由于牙髓組織被堅(jiān)硬的牙體組織所包裹，氧氣只能通過狹窄根管中的脈管系統(tǒng)才能到達(dá)牙髓細(xì)胞［3］。因此，牙髓組織中的氧含量比外圍組織更少，更容易因病理變化而導(dǎo)致低氧。同時(shí)牙齒所處的環(huán)境也使牙髓容易受到外界因素如細(xì)菌感染、過氧化物損傷等的影響［4］。

腺苷單磷酸激活蛋白激酶［Adenosine 5’－monophosphate(AMP)－ activated protein kinase，AMPK］是一種參與細(xì)胞能量調(diào)節(jié)的應(yīng)激蛋白酶［5］。AMPK在結(jié)構(gòu)上是一種由催化亞基(α1和α2)、調(diào)節(jié)亞基(β1 和 β2)以及 γ 亞基(γ1，γ2 和γ3)組成的異源三聚體蛋白［6］。AMPK可由細(xì)胞中增高的AMP/ATP水平所激活，并通過上游激酶的催化將其催化亞基的Thr172位點(diǎn)磷酸化。磷酸化后的AMPK即被激活，并可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中的能量水平而使細(xì)胞適應(yīng)低氧、低糖等周圍環(huán)境的脅迫［7］。已有研究證明，AMPK參與調(diào)控細(xì)胞在氧化環(huán)境中的生長(zhǎng)能力［8］。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞，觀察低氧預(yù)處理后細(xì)胞中AMPK基因的表達(dá)及其在細(xì)胞抵抗氧化環(huán)境中的作用，以期為進(jìn)一步研究牙髓細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美國(guó));噻唑藍(lán)(北京精華耀邦醫(yī)藥);Trizol試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DyNAmo SYBR Green qPCR試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)板(大連寶生物);Sanyo MCO－15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本)，VIIA 7實(shí)時(shí)定量 PCR儀(Applied Biosystems公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取19～29歲志愿者(知情同意)因阻生而拔除的健康第三磨牙，用PBS沖洗干凈后，于超凈工作臺(tái)上劈開，小心取出牙髓組織并用眼科剪剪碎，加入3 g/L I型膠原酶37℃下消化30～60 min。然后將消化后的組織塊平鋪于培養(yǎng)瓶底，加入適量含200 mL/L胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，瓶底向上置于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng);待組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)用2.5 g/L胰酶消化，按1∶2比例傳代。取第3代牙髓細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 觀察低氧預(yù)處理對(duì)人牙髓細(xì)胞AMPK基因表達(dá)的影響

取第3代人牙髓細(xì)胞，以1×104/孔的密度接種于24孔板，并將細(xì)胞隨機(jī)分為常氧組和低氧組。常氧組細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中，在常氧(950 mL/L空氣，50 mL/L CO2)條件下培養(yǎng);低氧組細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中，在低氧(10 mL/L O2，940 mL/L N2，50 mL/L CO2)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后取各組細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank中AMPK基因序列設(shè)計(jì)并合成引物(上海生工合成)，引物序列為:上游:5’－GGGTGAAGATCGGACACTACGT－3;下游:5'－ TTGATGTTCAATCTTCACTTTG －3';然后以cDNA為模板，以β－actin為內(nèi)參(其上游引物:5’－CTCCATCCTGGCCTCGCTGT－3’;下游引物:5’－GCTGTCACCTTCACCGTTCC－3’)用qRT－PCR儀檢測(cè)各組細(xì)胞中AMPK mRNA的表達(dá)水平。反應(yīng)體系共25 μL，分別為 DyNAmo SYBR Green qPCR mix 12.5 μL，上 下 游 引 物 各 0.5 μL;cDNA 模 板(＜10 ng/μL)2 μL;無 RNA 酶水 9.5 μL。反應(yīng)條件為:UNG酶50℃孵育2 min，94℃預(yù)變性10 min;94℃ DNA變性20 sec，引物在50℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，共36個(gè)循環(huán);72℃后延伸10 min。熔解曲線的制作條件為65～95℃，每0.2℃停留1 sec?；虮磉_(dá)的定量分析采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法:將克隆的DNA片段按10～104倍比稀釋后，由Opticon Monitor 2軟件產(chǎn)生最佳熒光基線和標(biāo)準(zhǔn)曲線;目的基因和β－actin基因的拷貝數(shù)分別根據(jù)產(chǎn)生的Ct值從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得。然后以目的基因的拷貝數(shù)除以 β－actin的拷貝數(shù)的比值作為靶基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 觀察低氧預(yù)處理對(duì)H2O2抑制牙髓細(xì)胞增殖的影響

取第3代人牙髓細(xì)胞，以1×104/孔的密度接種于24孔板，并將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，即常氧組、低氧組、常氧 +H2O2組、低氧 +H2O2組;然后按1.2.2的方法分別在常氧和低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其中常氧+H2O2組和低氧+H2O2組細(xì)胞于相應(yīng)條件下培養(yǎng)12 h后，分別于各孔中加入10 μL 0.1 mmol/L H2O2液處理4 h;然后各組細(xì)胞均更換常規(guī)培養(yǎng)液，并在正常條件下(37℃，950 mL/L空氣，50 mL/L CO2)繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h各時(shí)間點(diǎn)取各組細(xì)胞，每孔加入 20 μL MTT(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h;然后吸去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩混勻后用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔490 nm波長(zhǎng)的吸光度值(OD值)。

1.2.4 觀察AMPK基因過表達(dá)或沉默后牙髓細(xì)胞表達(dá)AMPK的變化

1.2.4.1 AMPK過表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

利用Trizol試劑盒提取人牙髓組織的總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，用含有 HindⅢ 和BamHⅠ 酶切位點(diǎn)的引物(上游引物:5＇－ CAAGCTTGCATAGATTAGCAGCATTGAAAGC－3＇;下游引物:5＇－ CGGATCCGAATACACCCACCAGAATAGCACA －3＇)對(duì)AMPK基因進(jìn)行擴(kuò)增;然后將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到p3XFlag－CMV中構(gòu)建AMPK過表達(dá)重組質(zhì)粒。取1 μL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌，并將其置于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜;次日4000 r/min離心10 min收集菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后以HindⅢ 和BamH I進(jìn)行雙酶切;酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

1.2.4.2 AMPK siRNA 的合成

根據(jù)Genbank中AMPK基因序列設(shè)計(jì)并合成siRNA，其具體序列為 5’ －GATCCGGTTGTATGCTGGTCC－3’(上海捷瑞合成)。

1.2.4.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和 AMPK mRNA 檢測(cè)

將第3代人牙髓細(xì)胞接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)，棄原培養(yǎng)液，并將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、AMPK過表達(dá)組、AMPK沉默(RNA干擾)組。其中正常對(duì)照組加入常規(guī)MEM(500 μL/孔)繼續(xù)培養(yǎng);過表達(dá)組加入含50 μL AMPK過表達(dá)重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒－LipofectamineTM2000復(fù)合物，質(zhì)粒濃度 4 μg/mL)的MEM(500 μL/孔)進(jìn)行轉(zhuǎn)染;沉默組加入含 50 μL siRNA(SiRNA－LipofectamineTM2000復(fù)合物，siRNA濃度120 Pmol/L的 MEM(500 μL/孔)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后，用qRT－PCR儀按1.2.2相同的方法分別檢測(cè)各組細(xì)胞中AMPK mRNA的表達(dá)水平。

1.2.5 觀察AMPK過表達(dá)對(duì)H2O2移植牙髓細(xì)胞增殖的影響

取第3代人牙髓細(xì)胞接種于24孔板，并將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，即:正常對(duì)照組、正常細(xì)胞 +H2O2處理組、AMPK過表達(dá)+H2O2處理組、AMPK沉默+H2O2處理組。其中正常對(duì)照組用常規(guī)MEM在正常條件下進(jìn)行培養(yǎng);H2O2處理組細(xì)胞加入 10 μL 0.1 mmol/L H2O2處理 4 h 后，然后換用常規(guī)MEM繼續(xù)培養(yǎng);AMPK過表達(dá)+H2O2處理組和AMPK沉默+H2O2處理組先按1.2.4.3的方法分別轉(zhuǎn)染AMPK過表達(dá)質(zhì)?；駻MPK siRNA后，再加入10 μL 0.1 mmol/L H2O2處理 4 h，然后換用常規(guī)MEM繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后24、48、72、96 h各時(shí)間點(diǎn)取各組細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，具體方法同 1.2.3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧預(yù)處理對(duì)牙髓細(xì)胞中AMPK基因表達(dá)的影響

為觀察低氧環(huán)境對(duì)細(xì)胞AMPK基因表達(dá)的影響，將牙髓細(xì)胞分別在常氧和低氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。12 h后RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，低氧組牙髓細(xì)胞中AMPK mRNA的表達(dá)水平顯著高于常氧組(P＜0.05)(圖1)。表明低氧環(huán)境能夠上調(diào)牙髓細(xì)胞中AMPK基因的表達(dá)。

圖1 低氧和常氧環(huán)境下牙髓細(xì)胞AMPK mRNA表達(dá)水平的比較(* 與常氧組相比P＜0.05)

2.2 低氧預(yù)處理對(duì)H2O2抑制牙髓細(xì)胞增殖的影響

將牙髓細(xì)胞分別置于常氧、低氧環(huán)境下培養(yǎng)12 h后，再用0.1 mmol/L H2O2處理細(xì)胞4 h;然后在常規(guī)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h各時(shí)間點(diǎn)用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示:不用H2O2處理時(shí)，常氧和低氧預(yù)處理的兩組細(xì)胞的增殖能力基本一致(P＞0.05)，均隨培養(yǎng)時(shí)間而逐漸增加;用H2O2處理后的常氧組和低氧組細(xì)胞的增殖能力均較其對(duì)照組顯著降低(P＜0.05);其中常氧+H2O2組細(xì)胞的增殖能力最低，與低氧+H2O2組相比，各時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。提示，低氧預(yù)處理能減輕氧化環(huán)境對(duì)牙髓細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。

圖2 各組牙髓細(xì)胞增殖能力比較

2.3 AMPK基因過表達(dá)或沉默后牙髓細(xì)胞表達(dá)AMPK mRNA的變化

分別將AMPK基因過表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染牙髓細(xì)胞6 h后，RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中AMPK mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞中AMPK mRNA的表達(dá)明顯受到抑制(P＜0.05)(圖3)。

圖3 AMPK基因過表達(dá)和沉默后牙髓細(xì)胞表達(dá)AMPK的變化(* 與對(duì)照組相比P＜0.05)

2.4 AMPK基因過表達(dá)對(duì)H2O2抑制牙髓細(xì)胞增殖的影響

為觀察AMPK基因在牙髓細(xì)胞抵抗氧化環(huán)境中的作用，以0.1 mmol/L H2O2分別對(duì)正常牙髓細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染AMPK過表達(dá)質(zhì)粒或siRNA的牙髓細(xì)胞處理4 h;然后換用常規(guī)MEM繼續(xù)培養(yǎng)，并用MTT法分別檢測(cè)各組細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72、96 h的增殖情況。結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，經(jīng)H2O2處理的各組細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后各時(shí)間點(diǎn)的增殖能力均明顯降低(P＜0.05);但AMPK基因過表達(dá)組受H2O2的影響最小，培養(yǎng)48 h后各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖能力均明顯高于正常細(xì)胞+H2O2組(P＜0.05);而 AMPK基因沉默(siRNA)組受H2O2的影響最明顯，培養(yǎng)24～96 h各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖能力均明顯低于其他各組(P＜0.05)(圖4)。以上結(jié)果表明，AMPK基因過表達(dá)有助于牙髓細(xì)胞抵抗氧化環(huán)境，可減輕氧化環(huán)境對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖4 AMPK過表達(dá)對(duì)H2O2抑制牙髓細(xì)胞增殖的影響

3 討論

牙髓細(xì)胞是指牙髓組織中的一種處于未(低)分化狀態(tài)，且可塑性強(qiáng)，并保持有分裂、增殖和分化能力的細(xì)胞群［9］。牙髓細(xì)胞對(duì)于牙本質(zhì)的形成和損傷修復(fù)均具有重要作用，但由于其在口腔環(huán)境容易受各種外界因素的影響而導(dǎo)致?lián)p傷，因此研究牙髓細(xì)胞抵御環(huán)境損傷的相關(guān)機(jī)制具有重要意義。

近年來關(guān)于不同細(xì)胞在低氧環(huán)境中的反應(yīng)，已有較多研究報(bào)道。Dippolito等［10］發(fā)現(xiàn)，人骨髓細(xì)胞在30 mL/L O2環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)，其分裂活性增高，并且維持不分化的狀態(tài)。Packer等［11］報(bào)道，人成纖維細(xì)胞在20 mL/L的O2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，不僅可使其分裂活性增高，同時(shí)還能延長(zhǎng)其生命周期。此外，關(guān)于低氧環(huán)境對(duì)大鼠、豬、犬、人等不同來源牙髓細(xì)胞的影響也有較多研究［12－13］。Wang等［14］報(bào)道，通過低氧環(huán)境培養(yǎng)能增強(qiáng)牙髓細(xì)胞的分裂活性，并使其STRO－1陽性細(xì)胞的比例增高。Iida等［13］發(fā)現(xiàn)與常氧條件相比，低氧環(huán)境培養(yǎng)不僅能使人牙髓細(xì)胞的增殖能力明顯增高，并且可使源于老年患者的牙髓細(xì)胞恢復(fù)分裂和分化的能力。AMPK是一種應(yīng)激調(diào)節(jié)蛋白酶，多種細(xì)胞環(huán)境如低氧、H2O2、缺糖、炎癥細(xì)胞因子刺激等均能影響其在牙髓細(xì)胞中的表達(dá)。Fkuyama等［15］發(fā)現(xiàn)，RPCC2A牙髓細(xì)胞在低氧濃度(20 mL/L)條件下培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞增殖率與正常氧濃度組(200 mL/L)相比無明顯區(qū)別，但低氧條件可上調(diào)牙髓細(xì)胞中AMPK蛋白的表達(dá);同時(shí)，將細(xì)胞中的AMPK基因沉默72 h后，無論在低氧條件下還是在常氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞的增殖均明顯下降。Zhou等在研究牙髓細(xì)胞的自噬現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)，AMPK/mTOR信號(hào)通路可介導(dǎo)細(xì)胞在低氧應(yīng)激中的自我吞噬;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，若利用復(fù)合體C抑制AMPK活性，則能導(dǎo)致牙髓細(xì)胞的凋亡［16］。本結(jié)果顯示，低氧預(yù)處理不僅能上調(diào)人牙髓細(xì)胞中AMPK基因的表達(dá)，同時(shí)還能增強(qiáng)細(xì)胞在氧化環(huán)境中的增殖能力，從而減輕H2O2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。

超氧負(fù)離子、H2O2、游離羥基以及氧負(fù)離子等均為細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的主要成分，并且能在細(xì)胞中互相轉(zhuǎn)化。在上述這些分子中，H2O2最為穩(wěn)定，也是細(xì)胞中ROS的主要存在形式。H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑，能在牙齒漂白過程中形成自由基，并能穿過釉質(zhì)和牙本質(zhì)進(jìn)入髓室中。有研究發(fā)現(xiàn)，牙齒漂白后其髓室中的 H2O2含量可達(dá)到 450 mmol/L［17］。目前已證實(shí)，H2O2能夠誘導(dǎo)牙髓組織壞死和細(xì)胞凋亡。Wu TT等發(fā)現(xiàn)，H2O2處理可導(dǎo)致人牙髓細(xì)胞的增殖能力降低，并可誘導(dǎo)細(xì)胞中caspase 3和caspase 9基因的表達(dá)水平顯著上升［18］。另有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK的激活能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Hwang JT等［19］在H9c2肌肉細(xì)胞中加入H2O2進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用白藜蘆醇激活細(xì)胞中的AMPK活性能使細(xì)胞獲得對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡的抗性。本結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，AMPK基因過表達(dá)能增強(qiáng)牙髓細(xì)胞在氧化環(huán)境中的增殖能力，并減輕H2O2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用;而通過RNA干擾使AMPK基因沉默后，則可導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力顯著下降。

綜合上述，低氧處理可上調(diào)牙髓細(xì)胞中AMPK mRNA的表達(dá)水平，并能減輕因H2O2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用;通過AMPK基因過表達(dá)可使牙髓細(xì)胞獲得對(duì)H2O2氧化的抗性，亦能減輕H2O2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。然而，關(guān)于AMPK在牙髓細(xì)胞氧化應(yīng)激中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

［1］Gronthos S，Brahim J，Li W，et al.Stem cell properties of human dental pulp stem cells［J］.J Dent Res，2002，81(8):531－535.

［2］Morito A，Kida Y，Suzuki K，et al.Effects of basic fibroblast growth factor on the development of the stem cell properties of human dental pulp cells［J］.Arch Histol Cytol，2009，72(1):51－64.

［3］Yu CY，Boyd NM，Cringle SJ，et al.Oxygen distribution and consumption in rat lower incisor pulp［J］.Arch Oral Biol，2002，47(7):529－536.

［4］Wang Y，Zhao Y，Jia W，et al.Preliminary study on dental pulp stem cell－mediated pulp regeneration in canine immature permanent teeth［J］.J Endod，2013，39(2):195 －201.

［5］Beauloye C，Marsin AS，Bertrand L，et al.Insulin antagonizes AMP－activated protein kinase activation by ischemia or anoxia in rat hearts，without affecting total adenine nucleotides［J］.FEBS Lett，2001，505(3):348 －352.

［6］Hardie DG.AMP－activated/SNF1 protein kinases:Conserved guardians of cellular energy［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(10):774－785

［7］Kim JE，Ahn MW，Baek SH，et al.AMPK activator，AICAR，inhibits palmitate－induced apoptosis in osteoblast［J］.Bone，2008，43(2):394－404.

［8］Davies SP，Helps NR，Cohen PT，et al.5＇－ AMP inhibits dephosphorylation，as well as promoting phosphorylation，of the AMP－activated protein kinase.Studies using bacterially expressed human protein phosphatase－2C alpha and native bovine protein phosphatase－2AC［J］.FEBS Lett，1995，377(3):421－425.

［9］Ruch JV.Odontoblast commitment and differentiation［J］.Biochem Cell Biol，1998，76(6):923－938.

［10］Dlppolito G，Diabira S，Howard GA，et al.Low oxygen tension inhibits osteogenic differentiation and enhances stemness of human MIAMI cells［J］.Bone，2006，39(3):513 － 522.

［11］Packer L，F(xiàn)uehr K.Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells［J］.Nature，1977，267(5610):423－425.

［12］Agata H，Kagami H，Watanabe N，et al.Effect of ischemic culture conditions on the survival and differentiation of porcine dental pulp－derived cells［J］.Differentiation，2008，76(9):981 －993.

［13］Iida K，Takeda－Kawaguchi T，Tezuka Y，et al.Hypoxia enhances colony formation and proliferation but inhibits differentiation of human dental pulp cells［J］.Arch Oral Biol，2010，55(9):648－654.

［14］Wang J，Wei X，Ling J，et al.Side population increase after simulated transient ischemia in human dental pulp cell［J］.J Endod，2010，36(3):453－458.

［15］Fukuyama Y，Ohta K，Okoshi R，et al.Hypoxia induces expression and activation ofAMPK in rat dental pulp cells［J］.J Dent Res，2007，86(9):903－907.

［16］Zhou Q，Liu H，Sun Q，et al.Adenosine monophosphate－activated protein kinase/mammalian target of rapamycin－dependent autophagy protects human dental pulp cells against hypoxia［J］.J Endod，2013，39(6):768－773.

［17］Benetti AR，Valera MC，Mancini MN，et al.In vitro penetration of bleaching agents into the pulp chamber［J］.Int Endod J，2004，37(2):120－124.

［18］Wu TT，Li LF，Du R，et al.Hydrogen peroxide induces apoptosis in human dental pulp cells via caspase－9 dependent pathway［J］.J Endod，2013，39(9):1151 －1155.

［19］Hwang JT，Kwon DY，Park OJ，et al.Resveratrol protects ROS－induced cell death by activating AMPK in H9c2 cardiac muscle cells［J］.Genes Nutr，2008，2(4):323 －326.