薛非凡，曾 麗，王麗玉，李炳森

(1．湖北省襄陽市食品藥品監(jiān)督管理局，湖北 襄陽 441021;2．湖北省襄陽市第五人民醫(yī)院，湖北 襄陽441000;3．珠海正太制藥有限公司，廣東 珠海 519110)

川貝清肺糖漿由枇杷葉、苦杏仁、川貝母、麥冬、地黃、甘草、桔梗、薄荷組方，功能主治為清肺潤燥、止咳化痰，用于治療風熱感冒引起的燥咳、咽干、咽痛。其收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑(第二冊)》，標準編號為WS3-B-0184-90，原標準無鑒別和含量測定。筆者增加了苦杏仁的理化鑒別，枇杷葉和甘草的薄層色譜鑒別及甘草酸的含量測定[1-10]，該方法可以更好地控制產品質量。

1 儀器與試藥

LC-10A型高效液相色譜儀(日本島津)，包括SPD-10AVP紫外檢測器、CBM-102工作站;CP-225D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);ZF紫外分析儀(上海康華生化儀器制造廠);KQ-100B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。枇杷葉對照藥材(批號為121261-200502)，甘草對照藥材(批號為 120904-200512)，甘草酸單銨鹽對照品(批號為110731-200614)，均購自中國藥品生物制品檢定所;硅膠G(青島海洋化工廠);甲醇、乙腈為色譜純，甲酸、冰醋酸、醋酸銨、三硝基苯酚、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚(60～90℃)、乙醇、丙酮，均為分析純。

2 方法與結果

2．1 理化鑒別(苦杏仁)

取本品適量，置試管中，試管中懸掛1條三硝基苯酚試紙[取三硝基苯酚適量，制成飽和水溶液，將濾紙條浸入其中，濕透后，取出，陰干，即得;臨用時，浸入碳酸鈉溶液(1→10)中，使均勻濕潤]。用軟木塞塞緊，置溫水浴中，20 min后試紙顯磚紅色。另取苦杏仁陰性樣品，同法操作，試紙不變色，陰性無干擾。

2．2 薄層色譜鑒別

枇杷葉:取本品30 mL，加水飽和的正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨試液萃取2次，每次30 mL，棄去水層，正丁醇液加正丁醇飽和的水30 mL洗滌1次，棄去水層，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含枇杷葉的自制樣品30 mL，同供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。另取枇杷葉對照藥材2 g，加水100 mL，加熱，保持微沸30 min，濾過，濾液濃縮至約30 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗[4]，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-丙酮(15∶7)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，缺枇杷葉的陰性樣品無干擾(見圖1 A)。

圖1 薄層色譜圖

甘草:取本品10 mL，加水10 mL，搖勻，加乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘渣加乙醇至1 mL，作為供試品溶液。取不含甘草的自制樣品10 mL，同供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。另取甘草對照藥材0．5 g，加水30 mL，加熱，保持微沸30 min，濾過，取濾液同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗[4]，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(12∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，缺甘草的陰性樣品無干擾(見圖1 B)。

2．3 甘草酸含量測定

2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Discovery C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水-冰醋酸(35∶65∶2);流速:1 mL/min;柱溫:27℃;檢測波長:250 nm。理論板數(shù)按甘草酸峰計算應不低于3 000。

2．3．2 溶液制備

精密吸取本品5 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇40 mL，超聲處理15 min，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，加甲醇制成每1 mL含 40 μg 的溶液(折合甘草酸為 39．18 μg)，即得對照品溶液。

2．3．3 方法學考察

圖3 高效液相色譜圖

測定波長選擇:取甘草酸單銨鹽對照品溶液適量，加甲醇制成適宜質量濃度的供試品溶液，于紫外分光光度計上掃描測定。結果在348．2 nm和249．0 nm波長處有最大吸收，參照中國藥典及相關文獻，選用250 nm作為測定波長。

干擾試驗:分別精密吸取樣品和不含甘草的陰性樣品溶液各10 mL，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液和陰性對照品溶液，分別吸取10 μL，注入液相色譜儀。結果在甘草酸峰相應的位置上，僅有微小色譜峰出現(xiàn)，其峰面積僅為樣品峰面積1．67%，表明陰性樣品對本品含量測定無明顯影響(見圖2)。

線性關系考察:精密稱取甘草酸單銨鹽對照品0．011 2 g，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得224 μg/mL的對照品溶液，精密吸取此溶液 20，5，5，5 mL，分別置 25，10，25，50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得 179．2，112，44．8，22．4 μg/mL的對照品溶液，精密吸取以上對照品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，測定峰面積。以甘草酸單銨鹽質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為 Y=641 433．1X-3 985．1，r=0．999 9(n=6)。結果表明，甘草酸單銨鹽進樣質量濃度在0～224 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取同一對照品溶液，連續(xù)進樣6次。結果峰面積分別為 242 296，243 916，244 139，245 168，250 999，250 961，平均 246 246．5，RSD=1．54%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，在 0，2，4，6，8，10 h 時進樣測定。結果峰面積分別為 183 831，184 960，183 008，182 890，182 141，181 150，平均 182 996．7，RSD=0．72%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內保持穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一批樣品6份，每份5 mL，依法制備供試品溶液并測定。結果樣品含量分別為 0．344，0．345，0．343，0．344，0．339，0．341 g/L，平均 0．342 g/L，RSD=0．58%(n=6)，表明方法的重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(含量為0．342 g/L)6份，分別添加甘草酸單銨鹽對照品溶液(0．252 g/L)適量，按擬訂方法測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 甘草酸加樣回收試驗結果(n=6)

耐用性試驗:考察改變流動相中有機相的量(±5%)、流動相的 pH(±0．2)、柱溫(25 ℃，40 ℃)、流速(±0．2 mL/min)對結果的影響。結果顯示，改變流動相中有機相的量、pH、柱溫、流速對結果幾乎無影響，說明方法耐用性較好。

2．3．4 樣品含量測定和含量限度確定

取10批樣品，分別照擬訂方法測定含量。結果見表2。10批含量測定結果表明，樣品中甘草酸的平均含量為0．305 g/L，按80%計，為0．244 g/L，故暫訂本品含量限度為每1 mL含甘草以甘草酸計，不得少于0．24 mg。

3 討論

苦杏仁所含的苦杏仁苷為氰苷，水解后產生氫氰酸，對呼吸中樞呈鎮(zhèn)靜作用，使呼吸運動趨于安靜而達到鎮(zhèn)咳的作用，為止咳的有效成分，故對其進行鑒別[2]。由于苦杏仁苷不穩(wěn)定，以其水解產物氫氰酸與三硝基苯酚試紙的顯色反應對其進行鑒別。

表2 樣品含量測定結果(g/L，n=10)

以文獻[1]甘草含量測定項下流動相甲醇-0．2 mol/L醋酸銨-冰醋酸(63∶37∶1)進樣測定，結果樣品中甘草酸色譜峰與相鄰雜質峰分離不好，且此流動相含緩沖鹽，對色譜柱傷害較大，平衡時間較長;以文獻[2]選用的乙腈-水-冰醋酸(35∶65∶2)為流動相，結果甘草酸色譜峰與相鄰雜質峰分離較好，理論板數(shù)較高，保留時間適宜，故選用此流動相作為本品的流動相。

精密吸取本品3份，每份10 mL，置50 mL容量瓶中，分別加50%甲醇、稀乙醇、流動相各40 mL，超聲處理15 min，放冷，分別加50%甲醇、稀乙醇、流動相稀釋至刻度，搖勻、濾過、進樣，測定各份樣品的含量，以確定提取溶劑。結果表明，3種溶劑中流動相提取含量最低(0．18 g/L)，稀乙醇和50%甲醇提取所得含量無明顯差別(0．20～0．22 g/L)。由于甲醇毒性大，從環(huán)保的角度考慮，故選擇稀乙醇作為提取溶劑。

精密吸取本品3份，每份10 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇40 mL，分別超聲處理10，15，25 min，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，測定各份樣品的含量，以確定提取時間。結果表明，超聲提取15 min即提取完全，故確定提取時間為15 min。

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