閻 婷 李海滔 趙明慧 蘇建新 董言德 李春曉 趙彤言

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100071)

白紋伊蚊Aedesalbopictus，嗜吸人血，是我國(guó)登革熱和登革出血熱的重要傳播媒介(安繼堯等，2003)。由于白紋伊蚊的孳生特點(diǎn)，環(huán)境治理和化學(xué)防治常常難以控制蚊蟲(chóng)密度，近年來(lái)，研究人員試圖從白紋伊蚊的生理行為方面尋找突破口，為發(fā)展新的防治方法奠定基礎(chǔ)。

蚊蟲(chóng)的很多行為，例如產(chǎn)卵、搜尋定位宿主、吸血等都依賴于嗅覺(jué)系統(tǒng)來(lái)完成(Takkenetal.,1999)。蚊蟲(chóng)通過(guò)嗅覺(jué)系統(tǒng)識(shí)別環(huán)境中的氣味分子，將化學(xué)信息編碼成電信號(hào)，傳遞給腦部，從而引起行為反應(yīng)(李慧等，2010)。在蚊蟲(chóng)嗅覺(jué)系統(tǒng)中，主要包括氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding protein，OBP)、氣味受體(Odorant receptor，OR)等多種嗅覺(jué)蛋白，其中氣味受體蛋白具有結(jié)合氣味分子的特性，已成為篩選蚊蟲(chóng)驅(qū)避劑或引誘劑的重要靶標(biāo)基因(徐煒，2009；李慧等，2010)。

二氧化碳(CO2)是人和動(dòng)物宿主呼出的主要?dú)怏w成分，也是蚊蟲(chóng)搜尋定位宿主的重要信息來(lái)源(Guerensteinetal., 2008; Hallemetal., 2008)，目前基于該原理的CO2誘蚊燈等設(shè)備已普遍應(yīng)用于蚊蟲(chóng)種群密度調(diào)查等試驗(yàn)，有研究證實(shí)CO2在一定的釋放范圍內(nèi)，隨濃度升高，捕獲的蚊種及數(shù)量均有增加(Klineetal., 1990; Klineetal., 1991)。對(duì)黑腹果蠅(Joneetal., 2006)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)受體Gr21a和Gr63a共同表達(dá)時(shí)表現(xiàn)出對(duì)CO2的敏感性，二者缺一不可。對(duì)岡比亞按蚊Anophelesgambiae(Hilletal., 2002)和致倦庫(kù)蚊Culexquinquefasciatus(Turneretal., 2009)的研究發(fā)現(xiàn)，與果蠅Gr21a和Gr63a同源的氣味受體基因，具有相似的表達(dá)方式，很可能也具有相同的功能(Hilletal., 2002)。如果有針對(duì)地研究與CO2相關(guān)的氣味受體，探索其分子機(jī)制，進(jìn)而干擾由CO2調(diào)節(jié)的蚊蟲(chóng)搜尋宿主的行為反應(yīng)，將會(huì)大大降低蚊蟲(chóng)吸血及傳播疾病的概率。

本研究通過(guò)同源擴(kuò)增的方法，獲得白紋伊蚊OR21a基因片段，應(yīng)用定量PCR技術(shù)比較未吸血雌蚊、打斷吸血雌蚊、飽血雌蚊和雄蚊頭部中OR21a基因起始表達(dá)量的差異，為推斷OR21a基因的功能和進(jìn)一步闡明白紋伊蚊嗅覺(jué)感受系統(tǒng)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng)

白紋伊蚊敏感株來(lái)源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所媒介生物學(xué)和防治研究室，蚊蟲(chóng)養(yǎng)殖條件為：溫度(26±1)℃、相對(duì)濕度65%±5%、光照∶黑暗=14 h∶10 h，成蚊喂食8%糖水，羽化3～5 d的蚊蟲(chóng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 白蚊伊蚊OR21a片段的克隆

1.2.1引物合成: 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中埃及伊蚊、致倦庫(kù)蚊和岡比亞按蚊的OR21a基因序列，使用Primer premier 6.0軟件，在相似度高的區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。上游引物OR1：5′- ATGATTCACA(G/C)(C/T/A)CAGATGGA -3′；下游引物OR2：′- GGTCA(A/G)(C/T)TTGAACTGCATCA -3′；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2白紋伊蚊OR21a基因的擴(kuò)增: 使用總RNA提取試劑盒(吉百特公司，DR202)提取白紋伊蚊5只雌蚊的總RNA，50 μL DEPC水溶解。取7 μL總RNA溶液，根據(jù)全式金公司 TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA溶液20 μL。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，包括Premix Taq(loading dye mix) 25 μL，模板cDNA 1.0 μL, 上游引物(20 μmol/L)1.0 μL, 下游引物(20 μmol/L)1.0 μL, ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件為94 ℃, 3 min；94 ℃ 45 s，5 5℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃, 7 min；4 ℃保存。取25 μL PCR產(chǎn)物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120 V 30 min)后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收及純化。

1.2.3PCR產(chǎn)物的克隆、鑒定和測(cè)序: 將純化的DNA片段和pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑篩選后，對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知物種核酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 白紋伊蚊OR21a基因的定量分析

1.3.1白紋伊蚊頭部cDNA 的獲得: 用手術(shù)刀切下白紋伊蚊未吸血雌蚊、雄蚊、打斷吸血雌蚊和飽血雌蚊的頭部，每1.5 mL冰上預(yù)冷的離心管中分別放入5只未吸血雌蚊、打斷吸血雌蚊、飽血雌蚊和雄蚊頭部。提取白紋伊蚊頭部總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2設(shè)計(jì)引物: 根據(jù)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增得到的氣味受體基因測(cè)序結(jié)果，使用Primer premier 6.0 軟件，設(shè)計(jì)特異引物，引物序列：上游為：5′-TCTTCACCACAATTATCGCCAC-3′,下游為：5′-GATGGCCACCAGAAACATTTC-3′。管家基因β-actin的引物序列參考文獻(xiàn)(閻婷等，2010)，引物由賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.3白蚊伊蚊OR21a和β-actin基因的擴(kuò)增: PCR反應(yīng)體系同(1.2.2)，反應(yīng)條件為94 ℃, 3 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃, 7 min；4 ℃保存。

1.3.4PCR 產(chǎn)物的克隆、測(cè)序和鑒定: 分別將兩條基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接，藍(lán)白斑篩選出的陽(yáng)性克隆經(jīng)檢測(cè)后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)鑒定。

1.3.5制備OR21a和β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線: 按照天根公司高純度質(zhì)粒試劑盒說(shuō)明書(shū)提取重組質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，按10倍梯度逐級(jí)稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品，范圍為103～108copies/μL。反應(yīng)體系總體積25 μL，包括Power SYBR Green PCR Master 2×Mix 12.5 μL，模板cDNA 1.0 μL, 上游引物(10 μmol/L)1.0 μL, 下游引物(10 μmol/L)1.0 μL, ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，熔解曲線反應(yīng)條件為:95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.3.6白紋伊蚊頭部OR21a和β-actin基因的定量分析: 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線后，用β-actin基因的拷貝數(shù)對(duì)OR21a基因的拷貝數(shù)進(jìn)行校正，比較OR21a基因在白紋伊蚊未吸血雌蚊、打斷吸血雌蚊、飽血雌蚊和雄蚊頭部表達(dá)量的差異倍數(shù)。

1.4 白蚊伊蚊OR21a基因在蚊蟲(chóng)不同發(fā)育階段的分布

使用1.3.2所設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)擴(kuò)增檢測(cè)OR21a基因是否在白紋伊蚊1～2齡幼蟲(chóng)、3～4齡幼蟲(chóng)、蛹和成蚊頭部中分布。

2 結(jié)果

圖1 白紋伊蚊OR21a和埃及伊蚊GR21a氨基酸序列及比較Fig. 1 Amino acid sequences of of AealOR21a and AedeGR21a and comparison within them方框:差異的氨基酸；Box: the difference of amino acids.

2.1 白紋伊蚊雌蚊OR21a基因的序列分析

圖2 白紋伊蚊基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of PCR products of Ae．a(chǎn)lbopictus genes fragmentM:DL2000 marker;1：β-actin基因擴(kuò)增條帶；2：OR21a基因擴(kuò)增條帶。M: DL2000; 1: β-actin amplification band; 2: OR21a amplification band.

以白蚊伊蚊cDNA為模板，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增克隆測(cè)序后，得到白蚊伊蚊OR21a基因測(cè)序(GenBank登陸號(hào)KM056288)，基因片段長(zhǎng)度為875 bp，預(yù)測(cè)編碼291個(gè)氨基酸片段。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核酸比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與其他蚊種OR基因的相似性大于75%。與埃及伊蚊GR21a氨基酸同源性最高，大于90%(圖1)，將克隆得到的該基因命名為OR21a。

2.2 白紋伊蚊OR21a基因的差異表達(dá)分析

2.2.1白紋伊蚊OR21a基因與管家基因β-actin的擴(kuò)增結(jié)果(圖2)：以白紋伊蚊未吸血雌蚊cDNA為模板，特異性引物擴(kuò)增白紋伊蚊OR21a、β-actin片段大小分別為248、194 bp，將PCR產(chǎn)物直接送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果完全與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線的制作(圖3～6)：白紋伊蚊OR21a和β-actin重組質(zhì)粒的濃度和OD比值分別為：370 μg/mL， A260/280=1.83；350 μg/mL，A260/280=1.80。將質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)后, 10倍濃度稀釋用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。從標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率可知OR21a和β-actin基因的擴(kuò)增效率較高，并且熔解曲線表明OR21a和β-actin基因都不存在非特異性擴(kuò)增。

圖3 β-actin定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of β-actin for real-time PCR

2.2.3OR21a基因表達(dá)量的定量分析結(jié)果：白紋伊蚊未吸血雌蚊、打斷吸血雌蚊、飽血雌蚊和雄蚊頭部中OR21a基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，并比較雌蚊吸血前后和雌雄蚊頭部OR基因的表達(dá)差異倍數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1和圖7。

表1 OR21a基因在白蚊伊蚊未吸血雌蚊、打斷吸血雌蚊、飽血雌蚊和雄蚊頭部的表達(dá)量Tab. 1 The OR21a expression level in the heads of non-feeding female, feeding-interrupted females, engorged female and male of Ae. albopictus

圖4 β-actin實(shí)時(shí)定量PCR熔解曲線Fig.4 Melting curve of β-actin for real-time PCR

圖5 OR21a實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作圖Fig. 5 Standard curve of OR21a for real-time PCR

圖6 OR21a實(shí)時(shí)定量PCR熔解曲線Fig. 6 Melting curve of OR21a for real-time PCR

圖7 OR21a基因差異表達(dá)倍數(shù)Fig. 7 The expression ratio of OR21a genes NF: 未吸血雌蚊 Non-feeding female; BIF: 打斷吸血雌蚊 Feeding-interrupted female; BF: 飽血雌蚊Engorged female; M: 雄蚊 Male.* 有顯著性差異，P<0.05。* Significant differences，P<0.05.

OR21a基因在未吸血雌蚊和打斷吸血雌蚊頭部表達(dá)沒(méi)有顯著性差異，但表達(dá)量有下降的趨勢(shì)；OR21a在未吸血雌蚊和雄蚊頭部和未吸血雌蚊和飽血雌蚊頭部之間表達(dá)都存在顯著性差異。其中白紋伊蚊OR21a基因在未吸血雌蚊頭部表達(dá)量最高，飽血雌蚊頭部表達(dá)量最低，而在雄蚊頭部的表達(dá)量介于打斷吸血雌蚊和飽血雌蚊之間。

2.3 OR21a基因在蚊蟲(chóng)不同發(fā)育階段的分布

從圖8上可以看出，OR21a基因在白紋伊蚊1～2齡幼蟲(chóng)、3～4齡幼蟲(chóng)、蛹、成蚊頭部中均有分布。

圖8 白紋伊蚊OR21a在幼蟲(chóng)、蛹、成蚊頭部的PCR結(jié)果Fig.8 Electrophoresis of PCR products of OR21a genes in the larvae, pupae, and head of adult femaleM:DL2000 marker;1: Or21a在1-2齡幼蟲(chóng)擴(kuò)增條帶；2：Or21a在3～4齡幼蟲(chóng)擴(kuò)增條帶；3：Or21a在蛹擴(kuò)增條帶；4：Or21a在成蚊頭部擴(kuò)增條帶。M: DL2000; 1: OR21a amplification band of first- and second-instar larvae; 2: OR21a amplification band of third- and fourth-instar larvae; 3: OR21a amplification band of pupae; 4: OR21a amplification band of female head.

3 討論

研究已證實(shí)蚊蟲(chóng)主要依靠嗅覺(jué)系統(tǒng)來(lái)完成定位宿主、吸血、產(chǎn)卵等行為，對(duì)蚊蟲(chóng)嗅覺(jué)系統(tǒng)的研究已成為發(fā)展蚊蟲(chóng)防治方法的新方向，但到目前為止蚊蟲(chóng)嗅覺(jué)具體的分子機(jī)理還知之甚少。岡比亞按蚊氣味受體的功能研究發(fā)現(xiàn)，一些氣味受體會(huì)對(duì)相應(yīng)的氣味物質(zhì)產(chǎn)生較強(qiáng)烈的反應(yīng)，同時(shí)某種氣味物質(zhì)也會(huì)引起一種或多種氣味受體的反應(yīng)，可見(jiàn)氣味物質(zhì)和氣味受體之間一定存在特殊的信號(hào)傳遞通道來(lái)控制蚊蟲(chóng)的行為(Careyetal., 2010)。蚊蟲(chóng)氣味受體數(shù)量普遍較多(Hilletal., 2002; Bohbotetal., 2007)，其中已知致倦庫(kù)蚊擁有個(gè)數(shù)最多，為130個(gè)(Xuetal., 2013)，氣味受體與其他嗅覺(jué)蛋白相互合作、共同發(fā)揮作用，可見(jiàn)蚊蟲(chóng)的嗅覺(jué)系統(tǒng)是一個(gè)相當(dāng)敏感、精細(xì)且可調(diào)節(jié)的系統(tǒng)，本研究嘗試有針對(duì)性地研究與感知CO2緊密相關(guān)的、可能在白蚊伊蚊搜尋宿主中起重要作用的氣味受體基因，希望為蚊蟲(chóng)嗅覺(jué)機(jī)理的研究及治奠定基礎(chǔ)。

分布結(jié)果表明，OR21a在白蚊伊蚊的各個(gè)生長(zhǎng)階段(幼蟲(chóng)、蛹及成蚊)均有表達(dá)，與果蠅Gr21a和Gr63a的表達(dá)方式相同(Jonesetal., 2006)，目前對(duì)OR21a在蚊蟲(chóng)幼蟲(chóng)及蛹階段表達(dá)所起的作用還需進(jìn)一步的研究。對(duì)果蠅的研究發(fā)現(xiàn)，1-乙醇和2,3-丁二酮通過(guò)作用于Gr21a和Gr63a受體，抑制神經(jīng)元對(duì)CO2氣體的電生理反應(yīng)，致倦庫(kù)蚊則不同， 1-乙醇和1-丁醛能抑制神經(jīng)元的生理反應(yīng)，而2,3-丁二酮沒(méi)有抑制作用(Turneretal., 2009)。可見(jiàn)，雙翅目昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期不同的進(jìn)化過(guò)程中，依循適者生存的原則，雖然屬于同源基因，但分子調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生了相應(yīng)的改變。

本研究克隆得到白紋伊蚊嗅覺(jué)感受機(jī)制中很可能與CO2相關(guān)的氣味受體基因OR21a，通過(guò)定量分析得知白蚊伊蚊OR21a在未吸血雌蚊、雄蚊、打斷吸血雌蚊、飽血雌蚊頭部的表達(dá)量存在差異，這說(shuō)明蚊蟲(chóng)會(huì)根據(jù)不同的生理需求調(diào)整OR21a的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明OR21a在蚊蟲(chóng)頭部的表達(dá)量從高至低依次為未吸血雌蚊、打斷吸血雌蚊、雄蚊和飽血雌蚊，可見(jiàn)蚊蟲(chóng)吸血后OR21a表達(dá)量呈降低趨勢(shì)，有可能由于吸血后蚊蟲(chóng)生理需求發(fā)生改變，對(duì)搜尋宿主的需求降低，進(jìn)而蚊蟲(chóng)對(duì)環(huán)境中CO2氣體的敏感度降低。在日后的研究中，可以嘗試采用RNAi技術(shù)，觀察白蚊伊蚊OR21a被部分或全部干擾后蚊蟲(chóng)的行為反應(yīng)，尤其是對(duì)宿主的識(shí)別能力，進(jìn)一步確認(rèn)OR21a的功能，為防治蟲(chóng)媒病提供新的思路。