薛 峰 黃敏君 洪彩玲 楊英超 甘紹伯 谷俊朝

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所，北京 100050； 2.熱帶病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050; 3. 中國(guó)食品藥品檢定研究院，生物制品檢定所，寄生蟲(chóng)疫苗室，北京 100050)

剛地弓形蟲(chóng)Toxoplasmagondii是細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，可引起人獸共患弓形蟲(chóng)病。我國(guó)人群平均感染率為4.0%～9.0%，孕婦感染率高達(dá)6.6%～32.9%(谷俊朝和甘紹伯，2008)。孕婦弓形蟲(chóng)病可引發(fā)胎兒先天感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、畸形、智力障礙等(Weissetal., 2009)。免疫力低下的病人，如器官移植和AIDS患者等，感染后可導(dǎo)致嚴(yán)重腦炎。弓形蟲(chóng)感染早期臨床癥狀不明顯且特異性差，尚未有特異有效的藥物，所以及時(shí)準(zhǔn)確的診斷方法和有效的疫苗對(duì)于該病防控和治療尤為重要(甘紹伯，2001)。目前，篩選免疫反應(yīng)性較強(qiáng)的抗原并應(yīng)用于改進(jìn)免疫學(xué)診斷方法和疫苗研制仍是研究熱點(diǎn)(盧致民和張進(jìn)順，2011)。

棒狀體蛋白(Rhoptry protein)是弓形蟲(chóng)主要分泌抗原之一，在弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞時(shí)經(jīng)蟲(chóng)體前端棒狀體釋放，參與納蟲(chóng)泡(Parasitophorous vacuole，PV)形成和維穩(wěn)(Sibley, 2004)。我們先前通過(guò)生物素標(biāo)記技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究表明，ROP2蛋白是弓形蟲(chóng)速殖子表達(dá)量最高的分泌蛋白(劉媛等，2013)。ROP2同源基因構(gòu)成一個(gè)較大的基因家族，包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP18等棒狀體蛋白基因(El Hajjetal., 2006)。該家族蛋白在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞早期均能分泌至納蟲(chóng)泡膜(Parasitophorous vacuole membrane，PVM)。基因敲除或沉默研究表明，ROP2家族蛋白大多是弓形蟲(chóng)重要的入侵和毒力作用因子，且往往具有酶活性(Sinaietal., 2001; Nakaaretal., 2003; Weilhammeretal., 2011)。另外，ROP2家族蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性和免疫保護(hù)性，對(duì)改進(jìn)免疫學(xué)診斷方法和研制亞單位重組疫苗具有重要意義(Labesseetal., 2009; Gatkowskaetal., 2010)。

本研究克隆了弓形蟲(chóng)RH株ROP2基因，構(gòu)建了全基因原核表達(dá)載體，在大腸桿菌工程菌中誘導(dǎo)表達(dá)了含GST和6×His標(biāo)簽的融合重組蛋白，并采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)了rROP2的免疫反應(yīng)性，為進(jìn)一步研究基于弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白的免疫診斷方法，以及分泌蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1弓形蟲(chóng)株系: 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株剛地弓形蟲(chóng)RH株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物寄生原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。本實(shí)驗(yàn)室綠猴腎Vero細(xì)胞體外傳代速殖子保種。

1.1.2宿主細(xì)胞系: 非洲綠猴腎Vero細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.1.3載體和工程菌株: pET-41 Ek/LIC快速連接原核表達(dá)試劑盒購(gòu)于Novagen公司，大腸桿菌NovaBlue測(cè)序菌株和RosettaTM(DE3) pLysS 工程菌株感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.4酶和相關(guān)試劑: DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol試劑、Superscript III 逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司。質(zhì)粒提取試劑盒、EX-Taq 高保真DNA聚合酶、pd(N)9逆轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物購(gòu)自大連TaKaRa公司。ProteinaShow-G250蛋白快速染色試劑、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、IPTG、Western Midview Western中分子量蛋白Marker、以及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。Anti-6×His tag小鼠單抗、Goat anti-Mouse IgG (H+L) HRP和Goat anti-Human IgG (H+L) HRP購(gòu)自Abcam公司。蛋白酶抑制劑購(gòu)自Amresco公司，層析柱、Ni-NTA瓊脂糖凝膠等購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司。弓形蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，內(nèi)含標(biāo)準(zhǔn)人源弓形蟲(chóng)混合抗血清)購(gòu)自珠海海泰生物制藥有限公司。其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1弓形蟲(chóng)速殖子體外培養(yǎng): 用含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞，傳代6 h后接種弓形蟲(chóng)速殖子(速殖子：宿主細(xì)胞=1：1)，4 d后收集純化弓形蟲(chóng)，約1×109個(gè)蟲(chóng)體采用Trizol方法提取總RNA。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成: 根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)公布的弓形蟲(chóng)ROP2基因序列(Q27007，B9QMZ1等)全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用以克隆ROP2基因全長(zhǎng)。

上游引物P1: 5′-GACGACGACAAGATGG-AAAACTGTGCGTCGGTCAGA-3′，下游引物P2: 5′-GAGGAGAAGCCCGGTCATGCCGGTTCTCCAT-CAGTTTG-3′。其中下劃線部分為載體重組序列，其余部分為ROP2基因特異性序列。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2.3生物信息學(xué)分析: 序列處理、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、親水性預(yù)測(cè)、抗原表位預(yù)測(cè)等分析分別采用DNAStar軟件包中的Editseq和Protean軟件。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用TMpred在線分析軟件。信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP-4.1在線分析軟件。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄與基因克隆: 使用Trizol試劑提取弓形蟲(chóng)總RNA，以TaKaRa pd(N)9隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物。于1 %瓊脂糖凝膠中電泳。采用QIAquick Gel DNA Extraction Kit純化回收PCR產(chǎn)物。

1.2.5表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定: 將純化后的PCR產(chǎn)物與pET-41 Ek/LIC載體于22 ℃重組連接, 按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌NovaBlue測(cè)序菌株，置于不含抗生素的SOC培養(yǎng)基中37 ℃振蕩1 h，將菌體平鋪含卡那霉素(30 μg/mL)的LB平板，挑取10個(gè)單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌RosettaTM(DE3) pLysS重組表達(dá)菌株中。挑取單個(gè)菌落，以RT-PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，保存陽(yáng)性克隆，并將質(zhì)粒送上海生工公司，采用載體通用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.6重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定: 在37 ℃，300 r/min搖培養(yǎng)菌至OD600=0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h后離心收集菌體，裂解后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。陽(yáng)性克隆擴(kuò)大至500 mL，誘導(dǎo)表達(dá)6 h后裂解并超聲粉碎，Ni-NTA凝膠柱進(jìn)行純化。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，查看純化效果，并采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)一步采用6×His標(biāo)簽單抗進(jìn)行Western blotting鑒定。一抗6×His標(biāo)簽單抗稀釋度為1：2500，二抗HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG稀釋度為1∶2000，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。

1.2.7鑒定重組蛋白免疫反應(yīng)性: 珠海海泰生物制藥有限公司生產(chǎn)的弓形蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)備有一份標(biāo)準(zhǔn)人源弓形蟲(chóng)混合抗血清陽(yáng)性對(duì)照，為多份確診弓形蟲(chóng)病患者血清的混合稀釋樣品。本研究以該抗血清為一抗，1∶20倍稀釋孵育，二抗HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG稀釋度為1∶2000，采用Western blotting免疫印跡評(píng)價(jià)rROP2免疫反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果與質(zhì)粒構(gòu)建

本研究擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度為1 713 bp(含上下游核酸重組序列30 bp)，其中ROP2基因全長(zhǎng)1 683 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分子量大小與預(yù)期值相符(圖1)。DNA片段與pET-41 Ek/LIC載體重組連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌NovaBlue測(cè)序菌株涂板。陽(yáng)性克隆的菌落PCR 顯示，擴(kuò)增DNA 片段與預(yù)期片段大小一致, 說(shuō)明重組質(zhì)粒含有目的基因(圖略)。

圖2 ROP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原表位和蛋白表面結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 2 Prediction of secondary structure, hydrophilicity, antigenic index, and surface plot of the ROP2 protein

圖1 采用RT-PCR克隆ROP2基因的結(jié)果Fig. 1 RT-PCR amplification of ROP2 geneM：DNA分子量DL2000；1：ROP2 基因RT-PCR產(chǎn)物；2：空白對(duì)照。M: DNA marker DL2000; 1: RT-PCR product of ROP2 gene; 2: Blank control.

2.2 測(cè)序驗(yàn)證與序列分析

將2個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工公司以載體通用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，克隆的靶基因序列長(zhǎng)度為1 713 bp，含有完整的ROP2開(kāi)放閱讀框(1 683 bp，編碼561個(gè)氨基酸，序列與NCBI-GenBank公布序列相符。DNAStar軟件包中Protean蛋白序列分析表明，ROP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以alpha螺旋為主，親水性結(jié)構(gòu)域多于疏水性結(jié)構(gòu)域，蛋白表面結(jié)構(gòu)域多于內(nèi)部結(jié)構(gòu)域，且抗原表位占蛋白序列的比例較高，應(yīng)該具有較好的免疫反應(yīng)性(圖2)。另外，TMpred跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，ROP2蛋白在前段和后段分別含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(12-29，445-465)(圖略)。SignalP 4.1信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明，ROP2蛋白前段26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列(圖略)。

2.3 重組蛋白電泳誘導(dǎo)表達(dá)

目的重組蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行初步驗(yàn)證，考馬斯亮藍(lán)-G250染色結(jié)果如圖3所示。誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白與與預(yù)期分子量(約98 kDa)相符。其中，ROP2蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為64 kDa，前端融合1個(gè)GST標(biāo)簽和1個(gè)6×HIS標(biāo)簽約34 kDa。

圖3 ROP2重組融合蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of ROP2 recombinant fusion proteinM：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：IPTG未誘導(dǎo)的重組大腸桿菌； 2：IPTG誘導(dǎo)6 h后ROP2融合蛋白表達(dá)。M: Protein low molecular weight marker; 1: Protein profile not induced by IPTG; 2. ROP2 fusion protein expressed after 6 h induction by IPTG.

圖4 ROP2重組融合蛋白Ni-NTA瓊脂糖凝膠純化效果Fig 4 Purification of recombinant ROP2 fusion protein using Ni-NTAM：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1: 純化后的ROP2重組融合蛋白；2: 未純化的ROP2重組蛋白對(duì)照。M: Protein low molecular weight marker; 1: Purified rROP2 fusion protein; 2: Unpurified rROP2 protein control.

圖5 ROP2重組融合蛋白的Western blotting鑒定Fig. 5 Verification of the recombinant ROP2 fusion protein using Western blotting.M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1: ROP2重組融合蛋白。M: Protein weight marker; 1: ROP2 recombinant fusion protein.

2.4 目的蛋白純化與Western blotting鑒定

采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱純化目的重組蛋白，并以SDS-PAGE電泳初步檢測(cè)。結(jié)果顯示98 kDa目的蛋白回收效率較高，純化效果較好(圖4)。Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱純化后的ROP2重組融合蛋白經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜后，用小鼠6×His單抗進(jìn)行Western blotting 鑒定。結(jié)果顯示98kDa特異性蛋白條帶，證明該目的蛋白為6×His 融合蛋白(圖5)。

2.5 重組蛋白免疫反應(yīng)性初步鑒定

圖6 ROP2重組融合蛋白與人源免疫抗血清的免疫反應(yīng)Fig. 6 Immunological reaction between rROP2 and human anti-T. gondii serumM：蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量; 1: ROP2重組融合蛋白。M: Protein weight marker; 1: ROP2 recombinant fusion protein.

以rROP2重組蛋白為抗原，以標(biāo)準(zhǔn)人源弓形蟲(chóng)感染混合血清為一抗，Western-blotting免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管來(lái)源于弓形蟲(chóng)病現(xiàn)癥患者的人源抗血清背景復(fù)雜，但98 kDa的rROP2重組蛋白與抗血清有顯著免疫印跡反應(yīng)。(圖6)。

3 討論

弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白2(ROP2)的編碼基因全長(zhǎng)約1.7 kb，第98～465位氨基酸序列中富含脯氨酸。ROP2蛋白存在翻譯后加工，由66 kDa蛋白切除信號(hào)肽和70多個(gè)氨基酸序列后僅剩余55 kDa。ROP2蛋白是弓形蟲(chóng)毒力因子，參與調(diào)節(jié)納蟲(chóng)泡膜功能調(diào)節(jié)，且能與宿主乳鐵蛋白互作，可能有助于弓形蟲(chóng)獲取生長(zhǎng)必需的鐵元素。另外，ROP2與宿主線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均有顯著相互作用，可能廣泛參與弓形蟲(chóng)的物質(zhì)和能量獲取和代謝過(guò)程。

本研究通過(guò)RT-PCR克隆ROP2基因全長(zhǎng)，并原核表達(dá)了GST-6×His-ROP2重組融合蛋白。本研究采用的pET41-EK/LIC表達(dá)載體與傳統(tǒng)的限制性酶切和連接反應(yīng)操作策略不同，該載體為線性載體，插入位點(diǎn)為L(zhǎng)IC結(jié)構(gòu)，無(wú)需限制性內(nèi)切酶和連接酶就可以通過(guò)基因重組進(jìn)行載體構(gòu)建，不僅方便易操作，而且能夠高效、定向地克隆，陽(yáng)性重組率>95%。該表達(dá)載體帶有GST和6×His兩個(gè)純化標(biāo)簽序列，便于表達(dá)后的純化，還具有在純化后以蛋白酶將載體的N端標(biāo)簽序列完全切除的優(yōu)點(diǎn)。

該重組蛋白N端雙標(biāo)簽封閉了ROP2酶活性，易獲得高表達(dá)量重組蛋白。通過(guò)選擇工程菌株，優(yōu)化誘導(dǎo)條件，原核系統(tǒng)也可以重組表達(dá)98 kDa大分子量蛋白。重組蛋白與人源弓形蟲(chóng)感染血清有顯著免疫印跡反應(yīng)。但人源弓形蟲(chóng)感染血清成分較為復(fù)雜，免疫印跡反應(yīng)中非特異性雜帶較多。由于蛋白免疫反應(yīng)性主要決定于蛋白一級(jí)序列，rROP2的免疫反應(yīng)性可以反映弓形蟲(chóng)ROP2蛋白的免疫反應(yīng)性。另外，本研究通過(guò)重組表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的ROP2全長(zhǎng)融合蛋白，為進(jìn)一步采用GST Pull-down等技術(shù)研究ROP2蛋白與宿主之間的相互作用，揭示弓形蟲(chóng)的感染機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。