劉 磊，李雪華，王 偉，羅卓卡，陳可塑，王中越，陳 龍，

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)科技部規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇南京 210046;2.常州市第四人民醫(yī)院，江蘇常州213032;3.南京大學(xué)金陵學(xué)院，江蘇南京 210089;4.泰州中國醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院，江蘇泰州 225300)

雙黃連中藥注射劑(Shuang－h(huán)uang－lian Injection，SHL)由金銀花、黃芩、連翹組成，臨床上用于病毒及細(xì)菌感染引起的上呼吸道感染，肺炎，扁桃體炎及咽炎等。臨床廣泛使用后，其不良反應(yīng)報道也逐年增加，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡［1］?；谄洳涣挤磻?yīng)機制為過敏反應(yīng)的理論［2－4］，臨床上常使用抗過敏反應(yīng)的藥物搶救雙黃連中藥注射液出現(xiàn)的致命性不良反應(yīng)，如β腎上腺素受體激動劑(腎上腺素)，糖皮質(zhì)激素和 H1受體拮抗劑(異丙嗪)［5－6］。然而，近年來的臨床［7－8］及基礎(chǔ)研究報道［9－10］，雙黃連中藥注射劑能夠?qū)е戮徛孕穆墒С！Ｍ瑫r有研究表明，H1受體拮抗劑異丙嗪加重雙黃連的心律失常，應(yīng)禁止使用異丙嗪［11－12］。本研究用實驗證明腎上腺素具有對抗雙黃連的致心律失常作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器

注射用SHL(凍干)(規(guī)格:每支600 mg，批號:1210019，哈藥集團中藥二廠提供)，鹽酸腎上腺素(規(guī)格:每支1 g·L－1，批號:120507，上海禾豐制藥有限公司提供)。RM－6240D型四道生理記錄儀，SWF－2W型微電極放大器(成都儀器廠);膜片鉗放大器(Axon instruments 200B，USA);數(shù)字－信號轉(zhuǎn)換器(Digidata 1322A美國Axon公司)。

1.2 動物

豚鼠體質(zhì)量250～300 g，雌雄不拘。由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2012－0008;實驗動物使用許可證:SYXK(蘇)2011－0053。

1.3 注射用雙黃連和腎上腺素劑量及濃度的計算

(1)在體實驗劑量的換算:人體與動物用量的轉(zhuǎn)化是按體表面積系數(shù)計算，按每公斤體質(zhì)量進行比較，豚鼠為人的4.6倍［13］。臨床上SHL用量為60 mg·kg－1，換算到豚鼠為 276 mg·kg－1(1 倍臨床劑量)，10倍臨床劑量為2760 mg·kg－1;臨床上腎上腺素(鹽酸鹽)成人極量為皮下注射1 mg，按照正常成人體質(zhì)量為60 kg計算，成人最大劑量為0.017 mg·kg－1，換算到豚鼠為 0.078 mg·kg－1(1倍臨床劑量)。

(2)離體實驗濃度的換算:人的細(xì)胞外液大約為 200 mL·kg－1(約為20%)，臨床上 SHL用量為60 mg·kg－1，換 算 到 臨 床 上 血 液 的 濃 度 為0.3 g·L－1，因此，實驗的組織和細(xì)胞灌流液1 倍臨床SHL濃度為0.3 g·L－1。臨床上腎上腺素(鹽酸鹽)成人極量為皮下注射1 mg，按照正常成人體質(zhì)量為60kg計算，人的細(xì)胞外液大約為200 mL·kg－1(約為 20%)，1 倍臨床腎上腺素(鹽酸鹽)的濃度為0.083 mg·L－1。

1.4 在體實驗

豚鼠ip給予20%烏拉坦(5 mL·kg－1)行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，分離出頸外靜脈，針形電極引導(dǎo)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，經(jīng)四道生理記錄儀采樣并存入計算機。

首先，將溶于生理鹽水的SHL在5 min內(nèi)以276 mg·kg－1(1 倍臨床劑量)→2760 mg·kg－1(10倍臨床劑量)的順序進行累計靜脈緩慢推注，注射后穩(wěn)定5 min。出現(xiàn)緩慢性心律失常后，順序給予溶于生理鹽水的腎上腺素0.0078 mg·kg－1(1/10臨床劑量)和 0.039 mg·kg－1(1/2臨床劑量)。于靜脈推腎上腺素5 min后記錄心電圖，分析心率(HR)、P－R 間 期、QTc 間 期。QTc=QT ×(1000)1/3/RR1/3(單位為 ms)［14］。

1.5 離體實驗

1.5.1 離體心電圖記錄

豚鼠ip給予20%烏拉坦(5 mg·kg－1)麻醉，開胸取心，置于0～4℃的無鈣灌流液中使之停搏，修剪分離主動脈，行主動脈插管后，結(jié)扎固定。采用Langendorf裝置，在37℃恒溫、充氧(95%O2+5%CO2)條件下，灌流液持續(xù)進行逆向灌流，調(diào)整流速約為4 mL·min－1，使心臟復(fù)跳。同時將3個電極分別置于心尖、右心室游離壁，主動脈根部，引導(dǎo)離體心臟的心電圖，經(jīng)四道生理記錄儀采樣并存入計算機。

首先按順序灌流SHL 0.3 g·L－1(1倍臨床濃度)→1.5 g·L－1(5 倍臨床濃度)，誘發(fā)緩慢性心律失常后，再灌流 SHL 1.5 g·L－1+ 腎上腺素0.42 mg·L－1(5 倍 臨 床 濃 度)，最 后 用 SHL 1.5 g·L－1和灌流液依次洗脫。上一濃度灌流結(jié)束后隨后灌流下一濃度，每一組灌流持續(xù)5 min，分別記錄各濃度組給藥5 min后的心電圖。分析HR，P－R，QRS和QTc間期。

心臟灌流液成分如下(mmol·L－1):NaCl 117，KCl 5.7，CaCl21.8，MgCl21.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，HEPES 20，葡萄糖11，用 NaOH調(diào)pH 至7.3。

1.5.2 單個心室肌細(xì)胞的分離

按改良的酶解法分離豚鼠單個左心室肌細(xì)胞。動物麻醉及離體心臟灌流同上，經(jīng)主動脈用含95%O2及5%CO2灌流液逆行灌流。用無鈣灌流液(37℃)沖洗并使心臟停跳。用含膠原酶Ⅰ型及胰蛋白酶(2及0.1 g·L－1)的無鈣灌流液反復(fù)灌流5～8 min，至心臟膨大、松弛。取下心臟，將左心室肌組織塊置于盛有無鈣灌流液中充分剪碎，用直徑200 μm 的尼龍網(wǎng)過濾，逐步加鈣至2 mmol·L－1，置于室溫下備用。灌流液的組成為(mmol·L－1):NaCl 117，KCl 5.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，MgCl21.7，HEPES 20，葡萄糖 20，牛磺酸 10。用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3。

1.5.3 動作電位的記錄

采用膜片鉗全細(xì)胞電流鉗法，在室溫(20～22℃)下進行。用細(xì)胞外液灌流，其組成為 (mmol·L－1):NaCl 117，KCl 5.7，NaHCO34.4，MgCl21.7，CaCl21.8，HEPES 20，葡萄糖20，牛磺酸20(NaOH調(diào)至pH 7.3)。充灌內(nèi)液的電極入水阻抗約為 2 ～5 MΩ，電極內(nèi)液為 (mmol·L－1):KCl 135，EGTA 10，HEPES 10，葡萄糖5，K2ATP 3，Tris－GTP 0.5(KOH 調(diào)至 pH 7.1)。在電流鉗模式下，調(diào)節(jié)電流刺激強度，使用能產(chǎn)生完好動作電位的最小電流刺激強度(通常為2～5 nA，100～200 ms)，信號的發(fā)放和采集均由pClamp 9.0軟件完成，并將數(shù)據(jù)存儲于硬盤內(nèi)。依次灌流SHL 0.3 g·L－1→1.5 g·L－1→3 g·L－1→SHL 3 g·L－1+ 腎上腺素0.83 mg·L－1(10 倍臨床濃度)，分別記錄各濃度組給藥5 min后的動作電位。分析動作電位復(fù)極于50%及90%水平的時程(APD50及APD90)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腎上腺素對雙黃連誘發(fā)的豚鼠在體心律失常的影響

圖1和表1的結(jié)果顯示，SHL 2760 mg·kg－1(10倍臨床劑量)能明顯降低豚鼠HR，延長P－R和QRS 間 期 (P＜0.05)。 而 給 予 腎 上 腺 素0.0078 mg·kg－1(1/10 臨床劑量)和0.039 mg·kg－1(1/2臨床劑量)則分別不同程度地提高了 SHL 2760 mg·kg－1臨床劑量所致的緩慢心率，同時，明顯改善 SHL 2760 mg·kg－1臨床劑量引起的 P－R，QRS間期的延長(P＜0.05)。

Fig.1 Representative traces of ECG before and after administration of Shuanghuanglian Injection(SHL)alone or SHL combined with adrenaline(Adr)in guinea pigs.A:before adminstration;B:SHL 276 mg·kg －1;C:SHL 2760 mg·kg －1;D:SHL 2760 mg·kg －1+Adr 0.0078 mg·kg －1;E:SHL 2760 mg·kg －1+Adr 0.039 mg·kg －1.

Tab.1 Effects of SHL alone and SHL plus Adr on heart rate(HR)，P－R，QRS and QTc intervals in anesthetized guinea pig hearts in vivo

2.2 腎上腺素對雙黃連誘發(fā)的豚鼠離體心律失常的影響

圖2和表2的結(jié)果顯示，SHL 1.5 g·L－1(5 倍臨床劑量)能明顯減慢 HR(P ＜0.05)。SHL 1.5 g·L－1(5倍臨床劑量)+腎上腺素0.42 mg·L－1(5倍臨床劑量)能明顯加快SHL 1.5 g·L－1所致的緩慢心率(P ＜0.05)，同時明顯縮短 QTc(P ＜0.05)。SHL 1.5 g·L－1(5倍臨床劑量)進行洗脫，可明顯減慢心率，并延長QTc(P＜0.05)。最后用灌流液進行洗脫，各參數(shù)基本能恢復(fù)至給藥前的水平。

Fig.2 Representative traces of ECG before and after perfusion of SHL alone or combined with Adr in isolated guinea pig hearts.A:before drug perfusion;B:after SHL 0.3 g·L －1perfusion;C:after SHL 1.5 g·L －1perfusion;D:after SHL 1.5 g·L －1+Adr 0.42 mg·L －1perfusion;E:after SHL 1.5 g·L－1 washout;F:after washout.

Tab.2 Effect of SHL alone or SHL combined with Adr on HR，P－R，QRS and QTc intervals in isolated guinea pig hearts

2.3 腎上腺素對SHL作用的豚鼠心肌細(xì)胞動作電位的影響

表3及圖3顯示，SHL 3 g·L－1(10倍臨床劑量)顯著延長電位復(fù)極于50%及90%水平的時程(APD50及 APD90)(P ＜ 0.05)，SHL 3 g·L－1(10倍臨床濃度)+腎上腺素0.83 mg·L－1(10倍臨床濃度)明顯縮短已延長的APD50或APD90(P＜0.05)，接近于正常對照水平。

Tab.3 Effect of SHL alone or SHL combined with Adr on action potential durations at 50%(APD50)or APD90in cardiomyocytes from guinea pig hearts

Fig.3 Representative traces of action potentials before and after perfusion of SHL alone or combined with Adr from cardiomyocytes of left ventricles of guinea pigs.

3 討論

本研究結(jié)果表明，在體豚鼠心電圖實驗顯示，SHL 10倍臨床劑量(2760 mg·kg－1)能明顯減慢豚鼠心率，延長P－R，QRS間期;1/10倍臨床劑量的腎上腺素(0.0078 mg·kg－1)和1/2倍臨床劑量的腎上腺素(0.039 mg·kg－1)能不同程度地對抗SHL的上述作用。離體豚鼠心電圖實驗顯示，5倍臨床濃度SHL 1.5 g·L－1顯著減慢豚鼠心率并延長P－R 間期，5 倍臨床濃度腎上腺素(0.42 mg·L－1)明顯對抗SHL的上述作用，并能縮短QRS間期。豚鼠心室肌細(xì)胞動作電位實驗表明，10倍臨床濃度SHL(3 g·L－1)顯著延長 APD50及 APD90，而 10 倍臨床濃度腎上腺素(0.83 mg·L－1)明顯縮短APD50及APD90，對抗雙黃連的延長作用。

本課題組前期研究也表明，SHL能通過抑制hNav1.5，L 型 Ca2+及 hERG 電流［10］降低豚鼠心率，延長P－R、QRS和QTc間期。而腎上腺素能增加 Na+［15］、L 型 Ca2+［16］、Ikr［17－18］及 Iks［19－20］電流，縮短豚鼠心肌細(xì)胞的動作電位時程，能有效地對抗SHL引起的緩慢性心律失常。

因此，臨床上當(dāng)SHL引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)又無法判斷其發(fā)生機制時，應(yīng)采用腎上腺素?fù)尵?，既可以對抗其可能的過敏反應(yīng)，又可以對抗其可能的緩慢性心律失常。

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