潘小平 洪曉綠

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有120萬婦女罹患乳腺癌，其中約50萬婦女死于該疾病，其發(fā)病率還以每年2%的速度遞增［1］。在我國占全身惡性腫瘤的7% ～10%，僅次于宮頸癌［2］。HER－2基因位于17號染色體，編碼生長因子受體，在20% ～30%的乳腺癌中高度表達［3］，并且該基因的表達與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后關(guān)系密切［4］，因此，檢測HER－2表達的情況不僅有助于評估患者預后，也有助于治療方案的選擇。目前，HER－2的檢測常采用免疫組織化學(IHC)法，但該方法只能檢測蛋白的含量，且影響因素較多，尤其是早期的乳腺癌中該蛋白含量較低，檢出率也較低。本研究采用不同的熒光素標記17號染色體的著絲粒和HER－2基因，建立全細胞熒光原位雜交(FISH)法，從分子基因水平檢測HER－2基因的表達，并評價該方法的臨床使用價值。

1 材料和方法

1.1 標本來源

選取2009年4月1日～2013年5月20日在我院接受乳腺手術(shù)且經(jīng)病理學證實為乳腺癌患者的乳腺組織160例，所有患者均被告知參與本項研究且得到患者同意。乳腺癌的分類參照WHO2003標準，標本的來源及構(gòu)成見表1，乳腺癌分期采用TNM分期(T:腫瘤大小，T0:原位癌;T1:腫瘤長徑≤2 cm;T2:2 cm＜癌瘤長徑≤5 cm;T3:＞5 cm;T4:不論腫瘤大小直接侵犯胸壁;N0:無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;N1～3:有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;Nx:區(qū)域淋巴結(jié)無法評估;G1:高分化;G2:中度分化;G3:低分化;Gx:不能判斷分化程度。)

表1 標本的來源及分類

1.2 試劑及儀器

熒光原位雜交成像分析系統(tǒng)，雜交儀，熒光探針，緩沖液(2×SSC，pH 7.0±0.2)，變性液(70%(v/v)甲酰胺/2×SSC，pH7.0～8.0)，乙醇，固定液(甲醇:冰乙酸體積比3∶1)，胃蛋白酶K工作液(0.08 mg/ml)等。

1.3 試驗方法

參照Jansen［5］等研究的方法在本實驗室條件下作如下改良:將4 μm厚的福爾馬林固定石蠟包埋切片根據(jù)標準的預處理程序進行處理［6］，切片經(jīng)二甲苯脫蠟后依次浸入100%、80%、70%酒精各10 min脫水，50℃下用30%［W/V］酸性亞硫酸鈉(sodium bisulfite)處理組織切片20～30 min，2×SSC溶液中漂洗5 min，將組織切片浸泡在蛋白酶K工作液(0.2 mg/ml)中，37℃孵育20～30 min，將玻片置于73～78℃的變性液中浸泡5 min后依次置于70%、80%和100%乙醇中梯度脫水，置于45～50℃烤片機上預熱3～5 min后與探針雜交，將10 μl探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片封片，置于濕盒中。42℃保溫箱雜交過夜后，滴加15 μl DAPI復染劑，暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 結(jié)果判斷

首先在HE染色切片上確認癌細胞區(qū)域，然后在10×物鏡下，F(xiàn)ISH標本上找到與HE染色切片上相同的組織細胞結(jié)構(gòu)，仔細觀察信號;在40×物鏡下掃描整張切片，觀察是否存在HER－2表達的異質(zhì)性，以及標本的質(zhì)量，滿意的標本應(yīng)是75%以上癌細胞核中都有雜交信號，在100×物鏡下觀察癌細胞核的FISH結(jié)果并進行信號計數(shù)和比值計算。隨機計數(shù)30個細胞，統(tǒng)計Ratio值(Ratio值=30個細胞核中紅信號總數(shù)/30個細胞核中綠信號總數(shù))。當Ratio值＜1.8，顯示無HER－2基因擴增;為陰性標本，當Ratio值＞2.2，顯示HER－2基因擴增;為陽性標本，當Ratio值介于1.8～2.2之間時，可增加計數(shù)30個細胞或重新做FISH實驗來判斷最終結(jié)果。單個細胞17號染色體著絲粒探針綠色信號大于2，即為17號染色體多體。

1.5 統(tǒng)計學分析

直接統(tǒng)計FISH陰陽性個數(shù)，F(xiàn)ISH陽性檢出率各組間的差異采用卡方檢驗，當n＜40時，采用Fisher精確概率法，p＜0.05時有統(tǒng)計學意義，所有數(shù)據(jù)及其結(jié)果均在SPSS for windows 13.0上進行。

2 結(jié)果

2.1 方法學建立結(jié)果

本研究較為成功地建立了熒光原位雜交法，且陰陽性結(jié)果均能達到試劑盒要求，即在熒光顯微鏡下均能見到各自特異性熒光顏色。圖1為乳腺癌陰性結(jié)果，在熒光顯微鏡下可見兩個17號染色體探針信號(綠色)以及兩個HER－2基因探針信號(紅色);圖2為FISH檢測乳腺異常結(jié)果，在熒光顯微鏡下計數(shù)30個細胞，其中紅色信號200個，綠色信號80個，Ratio值為2.5，即顯示HER－2基因擴增;判斷為陽性標本。且在同一個細胞中有三個綠色信號(黃色箭頭所示)，即該標本還有17號染色體多體存在。

2.2 臨床標本檢測結(jié)果

用建立好的FISH法檢測了160例乳腺癌石蠟標本，檢出結(jié)果見表2，從表中可以看出，F(xiàn)ISH總的陽性檢出率為38.8%(62/160)，隨著腫瘤增大，F(xiàn)ISH陽性檢出率越高，伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，陽性檢出率也越高，病理級別越高，其陽性檢出率也越高，但陽性檢出率在上述三組間并不存在統(tǒng)計學意義，見表3，但在組織類型組別，F(xiàn)ISH陽性檢出率存在顯著性差異(χ2=14.6，＜0.01)，見表3。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其檢測方法各式各樣，如高頻超聲、彩色多普勒顯像［7］，以及血氧功能檢測［8］等，但這些檢測方法的敏感性和特異性偏低，不能給臨床診斷與治療提供準確的依據(jù)。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，基因的改變早于形態(tài)的變化，因此，分子診斷技術(shù)在乳腺癌的診斷與治療過程中顯得尤為突出。HER－2基因與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后關(guān)系密切［4］，因此，準確檢測HER－2的表達情況對于乳腺癌患者的風險評估及預后有著重要意義［9］，也可指導是否采用赫賽汀單抗進行治療［10］。目前，HER－2基因的檢測主要包括PCR和IHC，PCR法檢測時污染嚴重，假陽性率高，IHC法，因其操作簡單價格廉價已廣為病理科應(yīng)用，但該檢測方法影響因素較多，如在標本固定和處理過程中容易破壞HER－2蛋白，實用抗體的批號之間存在差異等，這些均使得IHC結(jié)果準確率降低。而FISH法是一種基于細胞遺傳學的檢測技術(shù)，利用熒光素標記的探針對HER－2基因和17號染色體，直接和乳腺癌細胞進行雜交，穩(wěn)定性好，大大增強了檢測的特異性［11］。

表2 FISH陽性檢出率

表3 各變量之間的比較

在160例乳腺組織中，F(xiàn)ISH總體的陽性檢出率為38.8%(140/160)，與有關(guān)報道的陽性檢出率相差不大［12］。腫瘤越大，陽性檢出率越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量越多，陽性檢出率也越高，同樣，病理級別越高，陽性檢出率也越高，但在上述三組間FISH陽性檢出率并無顯著性差異，p值在各組間均＞0.05(比較結(jié)果見表3)，而在組織類型組織的比較中，F(xiàn)ISH陽性檢出率之間卻存在顯著性差異(χ2=14.6，＜0.01)，說明FISH在檢測HER－2基因擴增時與乳腺腫瘤的瘤體大小、病理級別以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目并無相關(guān)，而只與乳腺癌的組織類型有關(guān)，說明HER－2基因在導管型的癌體中表達較高。

因此，F(xiàn)ISH法能特異敏感地檢測出乳腺癌中HER－2基因的表達，檢測結(jié)果穩(wěn)定，不影響HER－2蛋白的表達，檢測的準確率高，能有效的指導臨床用藥，及時對乳腺癌患者進行風險評估，且該法操作簡單，結(jié)果快速，宜在臨床科室開展。

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