高樂 覃懷德 何鵬 曾日中

摘 要 天然橡膠主要來源于巴西橡膠樹。海南植膠土壤磷素缺乏，而缺磷會(huì)導(dǎo)致橡膠樹生長緩慢、干膠產(chǎn)量降低。本文通過RT-PCR技術(shù)從橡膠樹中克隆了一個(gè)磷饑餓信號(hào)關(guān)鍵調(diào)控基因HbPHR1，基因全長1 560 bp，包含一個(gè)1 476 bp的完整讀碼框（ORF），編碼491個(gè)氨基酸，分子量約為53.48 kD。HbPHR1具有MYB結(jié)構(gòu)域和CC結(jié)構(gòu)域，屬于MYB-CC家族成員，為酸性不穩(wěn)定蛋白，具有較強(qiáng)的親水性。進(jìn)化樹分析表明，HbPHR1與擬南芥AtPHR1、油菜BnPHR1歸為一個(gè)亞類。HbPHR1的克隆對(duì)解析橡膠樹磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、創(chuàng)制磷營養(yǎng)高效利用橡膠樹材料具有重要意義。

關(guān)鍵詞 橡膠樹 ；磷饑餓 ；HbPHR1 ；生物信息學(xué)

分類號(hào) S794.1

天然橡膠是重要的工業(yè)原料和國防戰(zhàn)略物資，主要來源于熱帶樹種——巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）。中國是橡膠消費(fèi)大國，國內(nèi)橡膠市場(chǎng)缺口巨大。磷對(duì)橡膠樹生長發(fā)育、產(chǎn)排膠具有重要的作用。供磷不足，會(huì)致使橡膠幼樹葉片數(shù)量明顯減少，根系生長不發(fā)達(dá)，干圍增長十分緩慢；對(duì)于已開割橡膠樹，會(huì)導(dǎo)致乳膠機(jī)械穩(wěn)定性下降，出現(xiàn)早凝減產(chǎn)，及膠乳干膠產(chǎn)量降低[1]。海南植膠土壤大部分pH值約4.7，屬于典型的酸性土壤，磷肥利用有效性低，低于我國平均利用率15%～25%[2]。以土壤全磷含量低于0.8～1.0 g/kg、速效磷含量50～80 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)來衡量海南膠園土壤磷素供應(yīng)水平，目前膠園土壤磷素供應(yīng)水平仍然處于較差狀態(tài)[3]。因此提高橡膠樹磷營養(yǎng)的利用效率對(duì)提高橡膠樹的產(chǎn)量具有重要作用。前人研究表明，AtPHR1在擬南芥磷信號(hào)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。AtPHR1具有MYB結(jié)構(gòu)域（MYB domain）和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域[coiled-coil （CC） domain]，屬于MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子家族成員。AtPHR1功能缺失會(huì)導(dǎo)致磷饑餓誘導(dǎo)基因（AtIPS1、AtRNS1和 At4）表達(dá)水平下降，葉片累積花青素[4]。AtPHR1以二聚體形式結(jié)合到不完全回文序列（GNATATNC）順式作用元件[5]。已有研究表明，許多磷饑餓誘導(dǎo)基因具有該順式作用元件，表明AtPHR1是磷饑餓信號(hào)途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]。目前，關(guān)于巴西橡膠樹磷信號(hào)途徑的研究較少，本文以擬南芥AtPHR1搜索橡膠樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[7]，克隆了橡膠樹磷饑餓信號(hào)調(diào)控基因HbPHR1，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。該基因的克隆對(duì)橡膠樹磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究及磷養(yǎng)分高效利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為橡膠樹主裁品種‘熱研7-33-97，通過Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行磷饑餓脅迫水培處理。磷饑餓脅迫處理水培液磷素的濃度為0 mg/L，收集低磷脅迫處理1 d的根部組織材料，液氮速凍后，-70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

橡膠樹根部組織RNA提取采用Tang等方法提取[8-9]，提取RNA后用DNaseⅠ去除殘留的微量DNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fementas）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 HbPHR1基因全長的克隆

根據(jù)EST拼接的序列設(shè)計(jì)基因特異性引物：5′端引物：5′-ATGGAGGCACGCCCTGC-3′，3′端引物5′-TTAGGCATCTGTTCTCG-3′。PCR反應(yīng)的總體系為20 μL，包括1 μL模板、引物各0.4 μL、含MgCl2的緩沖液10 μL、2.5 mmol/L dNTPs Mix 3 μL、1 U的LA Taq DNA聚合酶0.4 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，TaKaRa凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，連接在pMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α，挑取正確的克隆送往廣州英俊生物有限公司測(cè)序。

1.2.3 HbPHR1基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI Blastp軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，利用在線分析工具ProtParam分析蛋白的理化性質(zhì)，ProtScale在線分析蛋白的親水性，Tmpred在線分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域。在 NCBI 網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載具有MYB-CC結(jié)構(gòu)域的植物蛋白序列，利用ClustalX1.83 和 MEGA5.1軟件進(jìn)行基因進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbPHR1基因的克隆

通過HbPHR1基因特異引物擴(kuò)增出一條1 500 bp左右的條帶（圖1），所擴(kuò)增的目的條帶與預(yù)測(cè)的條帶大小一致。將擴(kuò)增的 DNA 片段回收測(cè)序鑒定，確認(rèn)該基因全長1 560 bp。

2.2 HbPHR1基因序列分析

HbPHR1基因包含一個(gè)1 476 bp的完整讀碼框，編碼491個(gè)氨基酸，分子量約為53.48 kD。NCBI結(jié)構(gòu)域分析表明，HbPHR1具有MYB（ MYB domain）結(jié)構(gòu)域和CC[coiled-coil （CC） domain]結(jié)構(gòu)域，屬于MYB-CC家族成員，與已知植物PHR1存在較高的同源性（圖2）。ProParam蛋白質(zhì)的理化分析表明，該蛋白絲氨酸Ser含量最高，為15.7%，其次為谷氨酸Glu（8.4%），含量最低的為半胱氨酸Cys和色氨酸Trp，為1.0%；酸性氨基酸數(shù)量（Asp+Glu）為59，堿性氨基酸數(shù)量（Arg+Lys）為43，理論等電點(diǎn)pI為5.45，屬于酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）為63.47，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.3 HbPHR1蛋白的疏水性/親水性分析

利用ProtScale預(yù)測(cè)HbPHR1蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)，分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，可以看出，多肽鏈第29位具有最高的分值1.489和最強(qiáng)的疏水性；第458位具有最低的分值-3.122和最強(qiáng)的親水性。橡膠樹HbPHR1的整條多肽鏈表現(xiàn)為較強(qiáng)的親水性。

2.4 HbPHR1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)TMPred分析，只有超過500分的才被認(rèn)為顯著。HbPHR1蛋白氨基酸序列分值均低于500分的顯著值，故可推測(cè)HbPHR1未含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.5 HbPHR1進(jìn)化樹分析

將HbPHR1與MYB-CC家族中的擬南芥、水稻、小麥、衣藻、油菜、菜豆成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖4）。分析結(jié)果表明，巴西橡膠樹HbPHR1與擬南芥AtPHR1、油菜BnPHR1歸為一個(gè)亞類，與水稻[Os-PHR1（NP_0010

50006）、Os-PHR2（AK100065）]，小麥[Ta-PHR1-A1（KC218925）、Ta-PHR1-B1（KC286910）、Ta-PHR1-D1（KC286911）]相距較遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

PHR蛋白為植物磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵調(diào)控蛋白，對(duì)植物的生長發(fā)育起著重要作用。過表達(dá)AtPHR1提高了擬南芥莖中磷含量，同時(shí)提高了磷轉(zhuǎn)運(yùn)子、磷酸酶、RNA酶等磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平[10]。同時(shí)AtPHR1還調(diào)控?cái)M南芥根系的生長，AtPHR1功能缺失突變體根毛長度變短，而超表達(dá)PHR1可在缺磷條件下促進(jìn)根毛的生長[11]。水稻中分離了2個(gè)與AtPHR1同源的基因OsPHR1和OsPHR2，過表達(dá)OsPHR2顯著提高莖葉磷含量，甚至?xí)?dǎo)致磷中毒。過表達(dá)小麥Ta-PHR1-A1可以提高磷的吸收及小麥穗粒數(shù)，進(jìn)而提高小麥產(chǎn)量。本研究在橡膠樹中克隆了PHR基因，基因全長1 560 bp，包含一個(gè)1 476 bp的完整讀碼框，編碼491個(gè)氨基酸，具有MYB結(jié)構(gòu)域和CC結(jié)構(gòu)域，屬于MYB-CC家族成員。不同品系的橡膠樹在磷利用率上存在基因型的差異[12]。HbPHR1基因的克隆為解析橡膠樹磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)，為創(chuàng)制磷營養(yǎng)高效利用橡膠樹材料提拱了基因資源，對(duì)提高橡膠樹磷素利用效率，節(jié)約磷礦資源，減少環(huán)境污染，促進(jìn)橡膠樹增產(chǎn)具有重要意義。

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