李丹瀅，方 蕓

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院藥學部，南京 210008

他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K506）是從土壤放線菌中分離出來的一種具有大環(huán)內(nèi)酯結構的新型強力免疫抑制劑。從1984年發(fā)現(xiàn)至今，己在臨床廣泛應用于各類器官移植和自身免疫系統(tǒng)疾病。FK506在體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A4/5藥物代謝酶代謝，再由P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）轉(zhuǎn)運。P-gp是由 ATP 結合蛋白（ABC）亞科 B運載體1基因（ABCB1），亦稱多藥耐藥基因1（MDR1）編碼之產(chǎn)物。

藥物基因組學認為，CYP3A4/5及P-gp的基因突變是造成FK506臨床療效個體差異顯著的原因之一[1-2]。目前僅明確CYP3A5*3基因多態(tài)性與FK506代謝相關，而ABCB1基因多態(tài)性對FK506的影響尚存爭議[3-5]。CYP3A4*18B是近幾年被發(fā)現(xiàn)的，在亞洲人群中具有較高突變頻率的基因多態(tài)位點[6]。若干研究已證實該位點可導致CYP3A4酶活性的上升，并與FK506和環(huán)孢素（cyclosporine，CsA）體內(nèi)代謝個體差異有關。

本研究旨在聯(lián)合考察CYP3A4*18B、CYP3A5*3及ABCB1單倍型與患者術后1個月內(nèi)FK506血藥谷濃度的相關性，進而在預測FK506最佳初始劑量的同時，也為用藥后劑量調(diào)整提供新的依據(jù)。

1 儀器與試劑

Viva-E型血藥濃度分析儀（Dade Behring Company Ltd.，Germany）；EDC-810 型基因擴增儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）。

FK506質(zhì)控試劑盒、標準曲線試劑盒及藥品試劑盒均為Dade Behring公司專用試劑。

FK506膠囊為沈陽安斯泰來有限公司產(chǎn)品；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物技術有限公司）；RsaI限制性內(nèi)切酶及PCR試劑（Promega，上海）。

2 方 法

2.1 研究對象

2006年4月至2011年11月，在我院泌尿外科行腎移植術后服用FK506的患者46例（男30例，女 16例），年齡為 14歲～57歲，平均年齡（34.8±8.1）歲；體重 34.0 kg～93.0 kg，平均體重（59.5±10.1）kg。患者均為首次接受腎移植手術，術后均采用常規(guī)三聯(lián)免疫抑制方案：FK506+嗎替麥考酚酯+糖皮質(zhì)激素，術后3～7天或消化道反應消失后開始給予FK506，分 2 次口服。嗎替麥考酚酯 2 g·d-1，分 2 次口服。糖皮質(zhì)激素術后第一天給藥96 mg，隨后每天減16 mg至16 mg維持。此研究已經(jīng)過本院倫理委員會批準，患者均自愿參加并已簽署知情同意書。

2.2 血樣采集與血藥濃度測定

口服FK506患者血藥濃度達穩(wěn)態(tài)后，于清晨給藥前采靜脈血1 mL，置肝素抗凝管中，采用酶增強免疫測定技術（EMIT）測定全血FK506谷濃度。

2.3 等位基因型測定

抗凝血標本在-25℃條件下保存。取抗凝血200 μL，按照試劑盒說明書從血樣中提取患者基因組DNA。 采 用 PCR-RFLP法 對 CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1（C1236T、G2677A/T、C3435T）共5個位點進行等位基因檢測，擴增引物見表1。實驗條件參考文獻[7]。

表 1 CYP3A4*18B、CYP3A5*3 及 ABCB1（C1236T，G2677A/T，C3435T）等位基因擴增引物及限制性內(nèi)切酶

2.4 數(shù)據(jù)分析

分別計算患者5個等位基因的基因頻率并進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。利用SHEsis軟件[8-9]分析患者5個等位基因間的連鎖不平衡關系，找出主要單倍型并計算頻率。Stata 10.0軟件則用于分析不同單倍型組間血藥濃度的差異。經(jīng)Shapiro-Wilk W檢驗呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Mann-Whitney U檢驗進行比較；呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則采用unpaired-T或one way ANOVA檢驗進行2組或3組間比較。P＜0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

3 實驗結果

3.1 CYP3A4*18B，CYP3A5*3 及 ABCB1（C1236T、G2677A/T、C3435T）等位基因頻率

46例腎移植患者CYP3A4*18B、CYP3A5*3及ABCB1（C1236T、G2677A/T、C3435T）基因型頻率及等位基因頻率見表2。對基因型分布進行Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度計算，結果顯示P＞0.05，基因頻率達到遺傳平衡，研究資料具有群體代表性。

表2 46例中國漢族腎移植患者CYP3A4*18B、CYP3A5*3及ABCB1（C1236T、G2677A/T、C3435T）基因頻率計算

連鎖不平衡分析結果見圖1。3種ABCB1等位基因中僅G2677A/T-C3435T及C1236T-C3435T間存在明確的連鎖不平衡關系，D’分別為0.94和0.71。對ABCB1單倍型作進一步分析后發(fā)現(xiàn)4種主要單倍型及4種次要單倍型。這4種主要單倍型及其頻率（1236-2677-3435）分別為：TGC（26.2%）、TTT（26.0%）、CGC（21.0%）、CAC（20.2%）。4 種次要單倍型共占6.8%（見圖2）。

圖1 CYP3A4*18B，CYP3A5*3，ABCB1 C1236T，G2677T/A及C3435T連鎖不平衡關系

圖2 46例中國漢族腎移植患者ABCB1單倍型及其頻率

圖3 46例中國漢族腎移植患者CYP3A4/5單倍型及其頻率

CYP3A4*18B及CYP3A5*3之間也存在明確的連鎖不平衡（D’=0.77）。CYP3A5表達患者攜帶CYP3A4*18B（A）等位基因的概率遠大于CYP3A4*1（G）。4種CYP3A4/5單倍型及頻率見圖3。

3.2 CYP3A4*18B，CYP3A5*3 及 ABCB1（C1236T、G2677A/T、C3435T）等位基因?qū)K506藥物濃度監(jiān)測結果的影響

為便于比較，根據(jù)個體給藥劑量和體重將血藥濃度標準化，以此觀察基因多態(tài)性對血藥濃度的影響。腎移植術后1個月內(nèi)（見表3），CYP3A5*3基因?qū)颊逨K506 C0/D值存在顯著性影響。突變純合型患者C0/D值在移植術后1～7、8～15及16～30天時分別為野生型患者的1.56、1.98及1.99倍。與CYP3A5*3等位基因不同，CYP3A4*18B基因僅在移植術后8～15及16～30天時對患者FK506 C0/D值有顯著性影響。野生純合型患者C0/D值分別為突變型患者的1.34及1.67倍。僅C3435T等位基因在移植術后8～15天與患者FK506 C0/D值顯著相關，其余2種ABCB1等位基因?qū)颊逨K506 C0/D值無顯著性影響。

3.3 單倍型對FK506藥物濃度監(jiān)測結果的影響

根據(jù)連鎖不平衡分析結果，對1種CYP3A4/5單倍型及2種主要ABCB1單倍型與FK506 C0/D值的相關性進行了研究。表4給出CYP3A4/5主要單倍型GG型對FK506血藥濃度的影響。GG型攜帶者與非攜帶者FK506 C0/D值在移植術后8～15、1～30天時存在顯著性差異，GG型攜帶者的C0/D為非攜帶者的1.43及1.77倍。未觀察到ABCB1基因主要單倍型TGC及CGC對FK506血藥濃度的影響，另外兩種ABCB1基因主要單倍型TTT及CAC，由于患者數(shù)量少（僅2人），故未作考察。

表3 中國漢族腎移植患者術后1月內(nèi)5種等位基因?qū)K506 C0/D值的影響

表4 中國漢族腎移植患者術后1月內(nèi)單倍型對FK506 C0/D值的影響

4 討論

FK506作為預防和治療排斥反應的基礎用藥，具有治療效果好、肝腎毒性小的特點。但該藥治療窗窄，個體間藥動學差異大，必須進行個體化給藥。毫無疑問，CYP3A5*3基因多態(tài)性與FK506的代謝有很強的相關性。它對FK506效應的影響早在首次劑量時就發(fā)生。但是ABCB1基因多態(tài)性與FK506的相關性目前仍在爭論之中。CYP3A4*18B等位基因是現(xiàn)在所有的CYP3A4等位基因中突變頻率最高的一個位點，已有研究發(fā)現(xiàn)該位點可使其代謝底物FK506清除率升高，血漿藥物濃度降低。

本研究中46例腎移植患者的CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1（C1236T、G2677A/T、C3435T）等位基因頻率分別為30.4%、70.7%、55.4%、47.8%及30.4%，均達到遺傳平衡，并與文獻報道的中國漢族人群各位點突變頻率[10]基本吻合。

研究結果顯示，移植術后8～15天及16～30天內(nèi)CYP3A4*18B與患者FK506 C0/D值存在顯著相關性，突變型患者C0/D值分別較野生純合型患者低25.5%和40.1%。這可能是由于該等位基因突變提高了CYP3A4酶活性，使其代謝底物清除率升高，血漿藥物濃度降低，從而表現(xiàn)為突變型患者的血藥濃度顯著降低。該結論與侯明明[11]的研究結果一致，提示該等位基因可能是導致FK506藥動學個體差異的又一重要遺傳因素。兩組不同的CYP3A5*3基因型患者FK506 C0/D值也存在顯著性差異，突變純合型患者C0/D值顯著高于野生型患者。該結果進一步支持了現(xiàn)有的結論，即野生型腎移植患者可能需要服用比較高劑量的FK506才能達到治療靶濃度范圍。本研究中，ABCB1基因C1236T位點與G2677T位點與FK506血藥濃度間無明顯相關性；僅C3435T位點為CC型的患者，在移植術后8～15天時需要更高劑量的FK506。這可能是由于三者間存在連鎖關系，對FK506藥動學的影響比較復雜，單獨一個突變的關系不能確定。

研究新發(fā)現(xiàn)，從CYP3A4/5單倍型考慮，GG型攜帶者與非攜帶者FK506 C0/D值存在顯著性差異。術后8～15天及16～30天內(nèi)，非攜帶者C0/D值為攜帶者的69.9%及56.5%。Shi等[12]也認為，雖然CYP3A4*18B和CYP3A5*3均與FK506藥代動力學參數(shù)相關，但單倍型的影響更大。他們利用NONMEM軟件計算后發(fā)現(xiàn)，GG型攜帶者的CL/F值為10.3 L·h-1，僅為非攜帶者的48.5%。GG型患者僅需服用較少的FK506，便可達到有效的血藥濃度范圍。研究并未發(fā)現(xiàn)ABCB1基因TGC及CGC單倍型對FK506血藥濃度的顯著性影響。有觀點認為：FK506是CYP3A酶和P-gp的共同底物。胃腸道P-gp的活性能夠調(diào)整CYP3A5酶對FK506的代謝，故評價P-gp獨立的功能應該選擇不表達CYP3A5酶的患者，即攜帶CYP3A5*3/*3基因型的患者[13]。因此Wang J等[14]對91例不表達CYP3A5酶的肺移植患者進行了ABCB1單倍型分析，結果ABCB1單倍型對FK506分布的影響有顯著性意義。移植后第1個月CGC-CGC患者FK506 C0/D值明顯低于CGC-TTT和TTT-TTT單倍型患者，且移植后3個月和12個月也有相似的發(fā)現(xiàn)。本研究由于樣本量少，故未作相似的統(tǒng)計分析，這可能是未發(fā)現(xiàn)ABCB1單倍型對FK506血藥濃度的顯著性影響的原因。

綜上所述，CYP3A4/5單倍型對腎移植患者術后一個月的FK506藥代動力學有影響，單倍型為GG型的患者僅需服用較低的劑量就可達到FK506的靶血藥濃度。器官移植前，對這兩個位點進行基因型檢測可以為FK506的個體化運用提供積極的指導作用。但導致FK506個體化差異的原因除遺傳因素之外，還和眾多臨床因素相關，因此應結合遺傳因素和腎移植術后的臨床特點，對其進行個體化給藥，盡可能地減少排斥反應和不良反應的發(fā)生，提高移植患者的生存率和生存質(zhì)量，同時減少患者的經(jīng)濟負擔。

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