李景松 張貴君

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102)

內(nèi)蒙古甘草為傳統(tǒng)道地的中藥。中藥甘草(Radix Glycyrrhizae)是豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根莖。甘草具有補(bǔ)脾益氣、止咳祛痰、清熱解毒、緩急定痛、調(diào)和諸藥的功能。

目前內(nèi)蒙古炙甘草補(bǔ)脾益氣的臨床應(yīng)用，本研究在中藥藥效組分理論的指導(dǎo)下[1]，依據(jù)其功能與主治，選用臨床上常用的四君子湯中，炙甘草的單味藥，2個(gè)藥對(duì)，四君子湯中的含量測(cè)定，探討內(nèi)蒙古炙甘草的質(zhì)量特征和評(píng)價(jià)方法。何三民[2]依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》使用HPLC法測(cè)定2010年版一部收載有甘草Lycyrrhiza uralensis Fisc.的甘草苷和甘草素、異甘草素的含量分別為3.64%、0.14%、0.125%。欒海云等[3]建立甘草中甘草苷含量測(cè)定的HPLC法，測(cè)定不同產(chǎn)地甘草中甘草苷的含量，以控制其質(zhì)量。劉磊等[4]采用HPLC法測(cè)定了同一產(chǎn)地、批次的生甘草和炙甘草中甘草苷和甘草酸的含量，發(fā)現(xiàn)蜜炙甘草后的甘草苷和甘草酸的含量增加，驗(yàn)證蜜炙因素可顯著增加甘草中二者的含量。張玲等[5]用HPLC法測(cè)定甘草酸和甘草苷含量在四君子湯復(fù)方中分別為1.41%和1.44%。劉紅文[6]使用薄層色譜法定性鑒別六味地黃丸中的甘草苷，使用液相色譜法測(cè)量甘草苷的含量，為該味成藥的生產(chǎn)提供相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。以控制其主要活性成分為甘草苷、異甘草苷、甘草素和異甘草素等甘草黃酮類(lèi)具有抑菌、以及保肝作用等活性[7－10]，和甘草皂苷類(lèi)成分質(zhì)量。四君子湯作為治療脾胃氣虛證，在中醫(yī)內(nèi)科脾胃氣虛證的治療中得到了廣泛的運(yùn)用[11]。甘草苷和異甘草苷具有抗?jié)?、抗菌、抗炎[12]，而其衍生物既能促進(jìn)胰島素的吸收，還具有抗心律失常、鎮(zhèn)痛、抗過(guò)敏、抗缺氧等作用[13]。

1 材料與方法

1.1 材料 儀器，Agilent 1100高效液相色譜儀(HP真空脫氣泵，HP四元泵，HP自動(dòng)進(jìn)樣，HP柱溫箱，HPDAD檢測(cè)器);Agela Venusil HPLC Clumns(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱;BP110S電子分析天平;BT25S型電子分析天平。

標(biāo)準(zhǔn)品，甘草苷(批號(hào):111208)，異甘草苷(批號(hào)120112)，甘草素(批號(hào) 120302)，甘草酸(批號(hào)111201)。甲醇為色譜純(購(gòu)自fisher公司)，水為娃哈哈純凈水。

內(nèi)蒙古野生炙甘草飲片，均購(gòu)于河北安國(guó)祁新飲片公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張貴君教授鑒定。

藥對(duì)又稱(chēng)“對(duì)藥”“對(duì)子藥”“姊妹藥”是指臨床常用的、相對(duì)固定的兩味藥物的配伍形式，是中藥配伍中的最小單位[14]。《神農(nóng)本草經(jīng)·序例》指出:“藥有單行者，有相須者，有相使者，有相畏者，有相惡者，有相反者，有相殺者，凡此七情，合和視之。藥對(duì)炙甘草－人參，配伍比例:炙甘草－人參3∶5;出處:四君子湯，《太平惠民和劑局方》。藥對(duì)炙甘草－白術(shù)，配伍比例:炙甘草－白術(shù)1∶1;出處:四君子湯，《太平惠民和劑局方》。復(fù)方四君子湯，組成:人參去蘆(10 g)，白術(shù)茯苓去皮、甘草炙(6 g)各等分;出處:四君子湯《太平惠民和劑局方》。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Agela Venusil HPLC Clumns(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－0.05%磷酸－ 水(0—8 min，19∶81;8—11 min，23∶77;11—21 min，24—76;21—44 min，50∶50;44—45 min，100∶0;45—50 min，19—81);流速:1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:室溫(30℃);檢測(cè)波長(zhǎng):237 nm、360 nm。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取適量對(duì)照品甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸[15]，分別置于 10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別得到濃度為 86 μg·mL－1、10 μg·mL－1、20 μg·mL－1、250 μg·mL－1的對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 按照各配伍比例稱(chēng)取甘草及其他中藥，加10倍量水浸泡30 min后煎煮兩次，第一次30 min，第二次20 min，合并煎液，趁熱過(guò)濾，濾液濃縮至每1 mL相當(dāng)于原藥材0.1 g的濃縮液，取濃縮液1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，靜置20 min，分出上清液，相對(duì)中藥濃度為 0.01 g·mL－1，即為供試液。進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣0.3、3、6、9、12、18 μL，異甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣1、4、8、12、16、20 μL，甘草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣1、3、6、9、12、18 μL，甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣 0.5、4、8、12、16、20 μL。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得甘草苷回歸方程Y=146.5X+20.51，R2=0.9993，表明甘草苷在25.800～154.800ng線性關(guān)系良好。異甘草苷的回歸方程Y=28.25X–1.177，R2=0.9996，表明異甘草苷在10.000～200.000 ng線性關(guān)系良好。甘草素的回歸方程Y=45.61X–0.022，R2=0.9996，表明甘草素在 20.000 ～360.000 ng線性關(guān)系良好。甘草酸的回歸方程Y=75.32X–0.398，R2=0.9998，表明甘草酸 125.000 ～5000.000 ng在線性關(guān)系良好。

2.2 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，安各成分的色譜條件測(cè)定峰面積。RSD分別為1.04%、1.51%、1.69%、1.19%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱(chēng)取內(nèi)蒙古野生炙甘草供試品6 g，按供試品按供試品的溶液的制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在 0，2，4，6，8，10，12 h 按2.1.1項(xiàng)下進(jìn)行峰面積測(cè)定，甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸RSD依次分別為1.93%，1.69%，1.46%，2.73%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試液 精密吸取同一批供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法連續(xù)測(cè)定6次，根據(jù)峰面積計(jì)算RSD值，得到4種組分重現(xiàn)性RSD值分別為1.84%，1.77%，1.64%，2.24%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取取內(nèi)蒙古野生炙甘草飲片6份，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備，分別精密加入4種基本等量標(biāo)準(zhǔn)品溶液，注入液相色譜儀進(jìn)行含量測(cè)定，見(jiàn)表1。

2.6 藥效組分測(cè)定 分別制備3批供試品，每個(gè)供試品連續(xù)進(jìn)樣3次，進(jìn)樣量10 μL，高效液相色譜測(cè)定峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算各組分的含量，見(jiàn)圖1－圖8，表2。

表1 內(nèi)蒙古野生炙甘草藥效組分加樣回收率測(cè)定

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜 見(jiàn)圖1－圖4。

圖1 甘草苷標(biāo)品HPLC圖譜

圖2 異甘草苷標(biāo)品HPLC圖譜

圖3 甘草素標(biāo)品HPLC圖譜

圖4 甘草酸標(biāo)品HPLC圖譜

2.6.2 單味藥圖譜 見(jiàn)圖5。

圖5 內(nèi)蒙古野生炙甘草HPLC圖譜

2.6.3 藥對(duì)圖譜 見(jiàn)圖6－圖7。

圖6 炙甘草－人參藥對(duì)HPLC圖譜

圖7 炙甘草－白術(shù)藥對(duì)HPLC圖譜

2.6.4 復(fù)方圖譜 見(jiàn)圖8。

圖8 四君子湯HPLC圖譜

2.7 四種藥效組分在單味藥、藥對(duì)、復(fù)方中的含量見(jiàn)表2。

表2 藥效組分含量(mg/mL)

3 討論

課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)藥對(duì)與復(fù)方配伍以后，四種藥效組分含量均有下降，且下降幅度較大。其中，單味藥與復(fù)方相比下降尤為明顯(甘草苷下降75%，甘草素下降75%，甘草酸下降74%，異甘草苷下降77%)?？梢钥闯?，由于配伍的變化影響著甘草藥效組分的溶出效率，而由于復(fù)方才是作為發(fā)揮作用療效的關(guān)鍵，并非一種或某幾種成分，而是多種成分的相互作用，所以，單純地把某一單體或幾個(gè)單體含量作為質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有欠妥當(dāng)，而應(yīng)該把療效與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來(lái)，將藥效組分作為質(zhì)量控制的多指標(biāo)。

就藥對(duì)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，藥對(duì)(炙甘草－白術(shù))四種藥效組分含量均高于藥對(duì)(炙甘草－人參)，藥對(duì)(炙甘草－白術(shù))與復(fù)方進(jìn)行比較(甘草苷下降60%，甘草素下降62%，甘草酸下降55%，異甘草苷下降58%)，而藥對(duì)(炙甘草－人參)與復(fù)方四君子湯中各項(xiàng)含量差別較小。由于許多方劑組成復(fù)雜而為質(zhì)量控制帶來(lái)不便，可從方劑中選擇合適的藥對(duì)或者其中幾味藥的藥效組分進(jìn)行質(zhì)量控制指標(biāo)，藥對(duì)代替復(fù)方的前提是務(wù)必選擇合適的，如本課題中藥對(duì)(炙甘草－人參)，倘若選擇欠佳，如課題中藥對(duì)(炙甘草－白術(shù))代替四君子湯則不利于質(zhì)量控制。但在復(fù)方組成并不太復(fù)雜的情況下，為了質(zhì)量控制的嚴(yán)謹(jǐn)性，應(yīng)盡量選擇整個(gè)復(fù)方作為控制載體。

本課題以?xún)?nèi)蒙古野生甘草單味藥、藥對(duì)以及復(fù)方作為研究載體，以探索甘草中藥效組分變化規(guī)律，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為藥效組分甘草苷－甘草素－甘草酸－異甘草苷在單味藥(內(nèi)蒙古野生炙甘草)中含量為(12.14±0.31)，(3.25 ±0.19)，(38.75 ±1.77)，(1.4 ±0.25);在藥對(duì)(炙甘草－人參)中含量為(2.87±0.04)，(0.74±0.02)，(6.42±0.18)，(0.37±0.03);在藥對(duì)(炙甘草－白術(shù))中含量為(5.99±0.01)，(2.16±0.09)，(22.4±1.8)，(0.77±0.02):在復(fù)方(四君子湯)中含量為(2.99±0.03)，(0.81±0.04)，(10.05±0.31)，(0.32±0.03)。其可以為甘草中藥材完善嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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