司云龍等

摘要：以巨大芽孢桿菌J1為材料，利用溶磷圈法測定了菌株的解磷能力，優(yōu)化了菌株的最佳發(fā)酵條件、最適培養(yǎng)基。結(jié)果表明，此菌株溶磷效果明顯；此菌株生長的最適培養(yǎng)時間為 28 h，最適接種量為6.7%，最適pH值為8.5；最佳碳源為玉米粉與葡萄糖的復(fù)合碳源，最佳氮源為大豆粉與硫酸銨的復(fù)合氮源。搖瓶培養(yǎng)的接種量為6.7%，pH值為8.5，250 mL 三角瓶中最適裝液體積為 30 mL，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時間為28 h，最適宜轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖瓶培養(yǎng)條件下，巨大芽孢桿菌活菌數(shù)各影響因素最佳組合為：玉米粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，大豆粉7.5 g/L，硫酸銨 0.33 g/L，各因子對巨大芽孢桿菌活菌數(shù)的影響由大到小依次為：硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。

關(guān)鍵詞：巨大芽孢桿菌；培養(yǎng)基；芽孢率；氮源；碳源；培養(yǎng)條件

中圖分類號： S144.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0359-03

收稿日期：2013-12-11

基金項目：國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：201210449130）。

作者簡介：司云龍（1990—），男，從事微生物肥料研究。E-mail：xiaosiwuqing@163.com。

通信作者：任麗麗，講師，從事微生物肥料研究。E-mail：tutuya_001g@163.com。植物生長發(fā)育過程中，磷元素以多種方式參與生物體內(nèi)的代謝過程，是植物不可缺少的大量元素之一[1-2]。土壤中的磷元素主要以難溶磷酸鹽的形式存在，可溶性磷含量很少。據(jù)統(tǒng)計，世界土壤的平均含磷量約為0.04%，我國土壤的平均含磷量為0.02%～0.1%，南方酸性土壤含磷量低于0.04%[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，土壤中存在解磷微生物，它們能夠?qū)⒘姿猁}轉(zhuǎn)化為可溶性磷供植物吸收利用，解磷菌還可以產(chǎn)生有機酸、生長素、抗生素等物質(zhì)，刺激作物生長，抑制病原菌生長，改善土壤微環(huán)境，從而更有利于植物生長發(fā)育[5-9]。目前對磷細菌的研究僅局限于菌種分離選育及作用效果比較方面，對于影響磷細菌生長的因素研究較少[10-13]。微生物種類多樣，發(fā)酵過程中受各種因素的影響，導(dǎo)致菌株發(fā)酵水平相對較低[14]。本試驗探討環(huán)境因素對巨大芽孢桿菌生長的影響，并在此基礎(chǔ)上探討該菌的最佳發(fā)酵條件，旨在為擴大巨大芽孢桿菌生產(chǎn)規(guī)模提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

巨大芽孢桿菌J1由山東京博控股股份有限公司技術(shù)中心生物化工研究所提供。

1.2培養(yǎng)基

搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米粉 30 g，大豆粉15 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4 2.0 g，CaCO3 1.5 g，MnSO4 0.05 g，H2O 1 000 mL，pH 值為7。平板培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，氯化鈉 5.0 g，牛肉膏粉 3.0 g，瓊脂15 g，H2O 1 000 mL。蛋黃培養(yǎng)基：將50%的蛋黃液按照6%的比例加入平板培養(yǎng)基中。

1.3方法

1.3.1巨大芽孢桿菌J1解磷效能測定 根據(jù)巨大芽孢桿菌J1在蛋黃培養(yǎng)基上形成的透明圈直徑判斷其解磷效能。

1.3.2培養(yǎng)條件對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

1.3.2.1pH值對巨大芽孢桿菌J1生長的影響采用搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于pH 值為5.5、6.5、7.5、8.5情況下180 r/min、30 ℃ 振蕩培養(yǎng)28 h 后進行平板計數(shù)。

1.3.2.2培養(yǎng)時間對巨大芽孢桿菌J1生長的影響采用搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，在pH值為8.5、轉(zhuǎn)速為175 r/min、30 ℃ 下分別振蕩培養(yǎng)24、28、32、36 h后進行計數(shù)。

1.3.2.3接種量對巨大芽孢桿菌J1生長的影響采用搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在 pH值為8.5、轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下將接種量分別為 3.3%、6.7%、10.0%的搖瓶置于振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃ 培養(yǎng)28 h 后進行計數(shù)。

1.3.3最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化按照設(shè)計方案，配制不同的培養(yǎng)基，250 mL三角瓶中每瓶裝量30 mL，原始pH 值為8.5，接種量為6.7%，180 r/min培養(yǎng)28 h后平板計數(shù)，采用正交試驗法找出最適培養(yǎng)基及最佳碳源、氮源。

2結(jié)果與分析

2.1巨大芽孢桿菌J1解磷能力的測定

由圖1可知，巨大芽孢桿菌J1在蛋黃培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d可產(chǎn)生明顯的溶磷圈，溶磷圈直徑與菌落直徑比值高達4.1，初步判斷巨大芽孢桿菌有解磷能力。

2.2pH值對巨大芽孢桿菌J1菌株生長的影響

由圖2可知，巨大芽孢桿菌J1在各pH值下長勢良好，在pH值為 8.5條件下生長最好，活菌數(shù)達35×107 CFU/mL。

2.3培養(yǎng)時間對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

由圖3可知，培養(yǎng)28 h 菌株生長最好，活菌數(shù)為 35×107 CFU/mL，芽孢率為84%，到達某一時間拐點后繼續(xù)培養(yǎng)，菌體會出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

2.4接種量對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

接種量對菌體生長有影響，所以接種量要適度，接種量過低會導(dǎo)致延滯期過長，菌體量不高；接種量過高，帶入培養(yǎng)基內(nèi)的代謝產(chǎn)物過多，反而不利于菌體生長。由圖4可知，當(dāng)接種量為 6.7% 時，菌株生長最好，活菌數(shù)為36×107 CFU/mL，芽孢率為86% 。

2.5碳源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

分別用30 g/L玉米粉、10 g/L葡萄糖、復(fù)合碳源（玉米粉、葡萄糖各減半混合在一起）配制碳源培養(yǎng)基，其他成分同搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基。接種后按照上述最佳培養(yǎng)條件，測定活菌總數(shù)及芽孢數(shù)，結(jié)果表明，采用玉米粉與葡萄糖的復(fù)合碳源作為培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)、芽孢數(shù)較高，活菌數(shù)達到36×107 CFU/mL，芽孢數(shù)達到35×107 CFU/mL（圖5）。

2.6氮源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

以玉米粉為碳源，在搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他成分不變的情況下，分別以15.0 g/L大豆粉、0.67 g/L硫酸銨、復(fù)合氮源（大豆粉、硫酸銨各減半）配制氮源培養(yǎng)基，接種后按照上述最佳培養(yǎng)條件，測定活菌數(shù)及芽孢數(shù)，結(jié)果表明，采用復(fù)合氮源培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)、芽孢數(shù)較高，活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL，芽孢數(shù)達33×107 CFU/mL，芽孢率達9591%（圖6）。

2.7正交試驗結(jié)果

以玉米粉與葡萄糖混合物作為碳源，以大豆粉、硫酸銨混合物作為氮源，結(jié)果表明，最佳組合為玉米粉20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，大

3結(jié)論與討論

巨大芽孢桿菌J1具有較強的解磷能力，在蛋黃培養(yǎng)基上解磷圈明顯。在培養(yǎng)基配方為玉米粉30 g，大豆粉15 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂2.0 g，碳酸鈣1.5 g，硫酸錳5.0 g，蒸餾水1 000 mL，轉(zhuǎn)速為180 r/min，溫度為30 ℃ 的培養(yǎng)條件下，巨大芽孢桿菌的最適pH值為8.5，活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL；最適培養(yǎng)時間為28 h，活菌數(shù)達到35×107 CFU/mL，芽孢率為84%；最適接種量為6.7%，活菌數(shù)達36×107 CFU/mL，芽孢率為86%。本研究表明，培養(yǎng)基成分是影響芽孢形成的重要因素。巨大芽孢桿菌對于碳源、氮源及 Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等離子反應(yīng)較敏感[15]。培養(yǎng)基配方不同直接導(dǎo)致發(fā)酵菌數(shù)存在巨大差異。搖瓶培養(yǎng)的接種量為67%，pH值為85，250 mL三角瓶中最適裝液體積為 30 mL，培養(yǎng)溫度為 30 ℃，培養(yǎng)時間為28 h，最適宜轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖瓶培養(yǎng)條件下，巨大芽孢桿菌活菌數(shù)各影響因素最佳組合為：玉米粉 20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，黃豆粉7.5 g/L，硫酸銨0.33 g/L，各因子對巨大芽孢桿菌活菌數(shù)的影響由大到小依次為：硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。 芽孢的形成是一個極其復(fù)雜的過程，受形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等多方面因素的影響。巨大芽孢桿菌培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于獲得較高活菌數(shù)的同時提高芽孢轉(zhuǎn)化率。本研究表明，巨大芽孢桿菌J1營養(yǎng)要求比較低，所需原料來源廣、成本低、芽孢率較高。本試驗獲得的最佳培養(yǎng)條件可以進一步應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。

參考文獻：

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[13]郭夏麗，狄源寧，王巖. 枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化[J]. 中國土壤與肥料，2012（3）：99-103.

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[15]張文芝，郭堅華. 微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（6）：114-117.

2.6氮源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

以玉米粉為碳源，在搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他成分不變的情況下，分別以15.0 g/L大豆粉、0.67 g/L硫酸銨、復(fù)合氮源（大豆粉、硫酸銨各減半）配制氮源培養(yǎng)基，接種后按照上述最佳培養(yǎng)條件，測定活菌數(shù)及芽孢數(shù)，結(jié)果表明，采用復(fù)合氮源培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)、芽孢數(shù)較高，活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL，芽孢數(shù)達33×107 CFU/mL，芽孢率達9591%（圖6）。

2.7正交試驗結(jié)果

以玉米粉與葡萄糖混合物作為碳源，以大豆粉、硫酸銨混合物作為氮源，結(jié)果表明，最佳組合為玉米粉20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，大

3結(jié)論與討論

巨大芽孢桿菌J1具有較強的解磷能力，在蛋黃培養(yǎng)基上解磷圈明顯。在培養(yǎng)基配方為玉米粉30 g，大豆粉15 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂2.0 g，碳酸鈣1.5 g，硫酸錳5.0 g，蒸餾水1 000 mL，轉(zhuǎn)速為180 r/min，溫度為30 ℃ 的培養(yǎng)條件下，巨大芽孢桿菌的最適pH值為8.5，活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL；最適培養(yǎng)時間為28 h，活菌數(shù)達到35×107 CFU/mL，芽孢率為84%；最適接種量為6.7%，活菌數(shù)達36×107 CFU/mL，芽孢率為86%。本研究表明，培養(yǎng)基成分是影響芽孢形成的重要因素。巨大芽孢桿菌對于碳源、氮源及 Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等離子反應(yīng)較敏感[15]。培養(yǎng)基配方不同直接導(dǎo)致發(fā)酵菌數(shù)存在巨大差異。搖瓶培養(yǎng)的接種量為67%，pH值為85，250 mL三角瓶中最適裝液體積為 30 mL，培養(yǎng)溫度為 30 ℃，培養(yǎng)時間為28 h，最適宜轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖瓶培養(yǎng)條件下，巨大芽孢桿菌活菌數(shù)各影響因素最佳組合為：玉米粉 20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，黃豆粉7.5 g/L，硫酸銨0.33 g/L，各因子對巨大芽孢桿菌活菌數(shù)的影響由大到小依次為：硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。 芽孢的形成是一個極其復(fù)雜的過程，受形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等多方面因素的影響。巨大芽孢桿菌培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于獲得較高活菌數(shù)的同時提高芽孢轉(zhuǎn)化率。本研究表明，巨大芽孢桿菌J1營養(yǎng)要求比較低，所需原料來源廣、成本低、芽孢率較高。本試驗獲得的最佳培養(yǎng)條件可以進一步應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。

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[15]張文芝，郭堅華. 微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（6）：114-117.

2.6氮源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

以玉米粉為碳源，在搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他成分不變的情況下，分別以15.0 g/L大豆粉、0.67 g/L硫酸銨、復(fù)合氮源（大豆粉、硫酸銨各減半）配制氮源培養(yǎng)基，接種后按照上述最佳培養(yǎng)條件，測定活菌數(shù)及芽孢數(shù)，結(jié)果表明，采用復(fù)合氮源培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)、芽孢數(shù)較高，活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL，芽孢數(shù)達33×107 CFU/mL，芽孢率達9591%（圖6）。

2.7正交試驗結(jié)果

以玉米粉與葡萄糖混合物作為碳源，以大豆粉、硫酸銨混合物作為氮源，結(jié)果表明，最佳組合為玉米粉20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，大

3結(jié)論與討論

巨大芽孢桿菌J1具有較強的解磷能力，在蛋黃培養(yǎng)基上解磷圈明顯。在培養(yǎng)基配方為玉米粉30 g，大豆粉15 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂2.0 g，碳酸鈣1.5 g，硫酸錳5.0 g，蒸餾水1 000 mL，轉(zhuǎn)速為180 r/min，溫度為30 ℃ 的培養(yǎng)條件下，巨大芽孢桿菌的最適pH值為8.5，活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL；最適培養(yǎng)時間為28 h，活菌數(shù)達到35×107 CFU/mL，芽孢率為84%；最適接種量為6.7%，活菌數(shù)達36×107 CFU/mL，芽孢率為86%。本研究表明，培養(yǎng)基成分是影響芽孢形成的重要因素。巨大芽孢桿菌對于碳源、氮源及 Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等離子反應(yīng)較敏感[15]。培養(yǎng)基配方不同直接導(dǎo)致發(fā)酵菌數(shù)存在巨大差異。搖瓶培養(yǎng)的接種量為67%，pH值為85，250 mL三角瓶中最適裝液體積為 30 mL，培養(yǎng)溫度為 30 ℃，培養(yǎng)時間為28 h，最適宜轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖瓶培養(yǎng)條件下，巨大芽孢桿菌活菌數(shù)各影響因素最佳組合為：玉米粉 20 g/L，葡萄糖5.0 g/L，黃豆粉7.5 g/L，硫酸銨0.33 g/L，各因子對巨大芽孢桿菌活菌數(shù)的影響由大到小依次為：硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。 芽孢的形成是一個極其復(fù)雜的過程，受形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等多方面因素的影響。巨大芽孢桿菌培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于獲得較高活菌數(shù)的同時提高芽孢轉(zhuǎn)化率。本研究表明，巨大芽孢桿菌J1營養(yǎng)要求比較低，所需原料來源廣、成本低、芽孢率較高。本試驗獲得的最佳培養(yǎng)條件可以進一步應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。

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