李偉澤，趙 寧，韓文霞，周永強(qiáng)

（西安醫(yī)學(xué)院陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安710021）

豬高熱綜合癥對集約化、規(guī)?；酿B(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。目前，臨床上常用激素、解熱鎮(zhèn)痛與抗生素類藥物治療，這些藥物的退熱效果好，但能夠降低患豬的免疫功能與抗應(yīng)激能力［3］；另外，不合理使用抗生素也會誘發(fā)其他不良反應(yīng)［4］，抗生素由于不易代謝還可通過食物鏈對人類社會造成潛在的危害［5］。中草藥活性成分為天然獲取，在豬只體內(nèi)易代謝、不殘留、不污染生態(tài)環(huán)境，符合健康養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢［6-7］。傳統(tǒng)中藥水針劑由于制備工藝的限制只能保留水溶性部位而將療效顯著的揮發(fā)油類損失，因而，在一定程度上弱化了中藥的療效。納米膠束能夠增加脂溶性藥物在水溶液中的溶解度，且形成的膠束體系是一個澄清透明的熱力學(xué)和動力學(xué)穩(wěn)定體系［8］，在藥劑學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。本文首次將揮發(fā)油以納米膠束的形式增溶于中草藥的水溶性藥液中制備獸用“復(fù)方草連”納米注射液（專利號：201310015265.4），并研究了其相關(guān)性質(zhì)與退熱作用，以期為我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供一種中草藥綠色獸藥。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 安乃近注射液，邯鄲市格潤動物藥業(yè)有限公司，批號20120705；乙醇、丙三醇、聚山梨酯-80，南京威爾化工有限公司；石油醚，天津化學(xué)試劑，分析純；老鸛草、連翹、防風(fēng)、柴胡、知母、刺五加，購于西安怡康藥店，經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版二部。

1.2 儀器 GCMS-QP2010氣-質(zhì)聯(lián)用色譜儀；Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀；CELL-DYN?1200血細(xì)胞分析儀；H-7000透射電鏡；JY2002型電子天平；Cogent-M1型半自動超濾系統(tǒng)；微孔濾膜過濾器；揮發(fā)油提取裝置，自制。

1.3 動物 發(fā)熱病豬24頭（非急性傳染性發(fā)熱），體重70 kg，山西省芮城縣某養(yǎng)豬場。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 J＆W DB-17彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱初溫 60 ℃，保溫1 min，然后以5℃／min升溫速率升至230℃，保溫3 min；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為高純氦氣（＞99.999%）；柱前壓 57.4 kPa，柱流量 1 mL／min，分流比 1：30；進(jìn)樣量為 1 μL。

1.4.2 中藥材提取 稱取處方量老鸛草、連翹、防風(fēng)、柴胡，混合后加入12倍量的水，浸泡30 min，蒸餾并收集揮發(fā)油約7.5 mL，密閉，備用；分離煎煮液和藥渣，藥渣再煎煮提取2次，每次25 min，將所得藥液合并，得到提取液1，備用；

取處方量知母與刺五加，加入10倍量的水，浸泡25 min，煎煮提取40 min，分離提取液和藥渣；藥渣中再加入8倍量的水提取2次，每次30 min，將3次提取液合并，得到提取液2。

1.4.3 藥液精制 提取液1與提取液2合并，減壓濃縮至清膏（每毫升相當(dāng)于生藥材2.5 g左右），放至室溫，加入乙醇使含醇量到65%，4℃冷藏24 h，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，加5%的明膠液280 mL，攪勻，再加乙醇使含醇量到85%，4℃冷藏24 h，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，并濃縮得到清膏；加注射用水至500 mL，再加入5 mL聚山梨酯-80，攪勻，4℃冷藏24 h，過濾，得水沉液；水沉液經(jīng)過超濾（截留分子量10000），得超濾液，備用。

1.4.4 “復(fù)方草連”納米注射液制備 將7.5 mL揮發(fā)油與45 mL聚山梨酯-80、30 mL丙三醇混勻，再緩慢加入1.5.2中的超濾液，攪勻，加注射用水至600 mL，于4℃冷藏72 h，過濾除掉沉淀，得濾液；濾液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾2次后灌封（10 mL／支），滅菌，即得。

1.4.5 揮發(fā)油膠束的考察 取適量樣品液滴于銅載網(wǎng)上，晾干，置于2.0%磷鎢酸溶液中染色，用濾紙吸取多余的染色液，晾干，置于透射電鏡下觀察其外觀結(jié)構(gòu)；另取適量樣品液注入激光粒度分析儀，測定其粒徑和表面Zeta電位。

1.4.6 納米膠束中揮發(fā)油的氣相色譜圖取新制備的樣品50 mL，用石油醚萃取2次，將萃取液合并后按照上述色譜條件測定揮發(fā)油的氣相色譜圖；將適量樣品置于溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%的加速試驗(yàn)條件下放置6個月，然后按照上述處理方法處理，測定6個月后的揮發(fā)油的氣相色譜圖。

1.4.7 對患豬的治療情況

1.4.7.1 對發(fā)熱狀態(tài)的影響 將患豬隨機(jī)分為2組，每組12頭。第1組為安乃近注射液組：每頭按安乃近5 mL／kg（安乃近含量30%）肌肉注射安乃近注射液；第2組為“復(fù)方草連”納米注射液組：每頭按0.5 mL／kg肌肉注射“復(fù)方草連”納米注射液（每毫升相當(dāng)于原生藥材2.87 g）。2組早晚各給藥1次，連用3 d后，分別測試肛溫并作好記錄，并觀察臨床癥狀。

1.4.7.2 對外周血液T細(xì)胞亞群CD3+和CD4+含量（%）的影響 將2組患豬分別于給藥前與給藥3 d后，進(jìn)行前腔靜脈無菌采血，血液樣品用血細(xì)胞分析儀測定T淋巴細(xì)胞亞群的CD3+和CD4+含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的制備 采用超濾技術(shù)與聚山梨酯-80兩步加入方式所制備的“復(fù)方草連”納米注射液，在40±2℃條件下放置6個月仍然澄清透明。如不采用超濾技術(shù)，則在相同條件下放置20 d左右，藥液即可出現(xiàn)渾濁與掛壁現(xiàn)象；在制備過程中如將揮發(fā)油與聚山梨酯-80混合后直接加入藥液，就會產(chǎn)生少許沉淀［9］而影響制劑的澄明度。

2.2 揮發(fā)油膠束的考察 本文所制備的揮發(fā)油膠束在電鏡下觀察為大小均勻的圓球型結(jié)構(gòu)，（圖1）；其粒徑為100±12 nm，（圖2），表面 Zeta電位為-83.2±0.8 mV（圖3）。一般而言，當(dāng)納米顆粒的Zeta電位絕對值高于30 mV時，納米粒表面就存在大量凈電荷，凈電荷產(chǎn)生的靜電排斥力有利于提高納米顆粒的穩(wěn)定性并促使其粒徑大小均勻［10］。

圖1 揮發(fā)油膠束的透射電鏡照片

圖2 揮發(fā)油膠束的粒徑分布

圖3 揮發(fā)油膠束的表面Zeta電位

2.3 納米膠束中揮發(fā)油的穩(wěn)定性 揮發(fā)油易揮發(fā)、易氧化，因而揮發(fā)油的穩(wěn)定性對于藥效發(fā)揮具有重要作用。將“復(fù)方草連”納米注射液置于溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%條件下放置 6 個月，第0個月與第6個月的氣相色譜圖如圖4、5所示。圖4、5中主要色譜峰的峰數(shù)目、峰形、峰高與位置等基本一致，表明揮發(fā)油在加速試驗(yàn)條件下放置6個月基本未發(fā)生變化，說明膠束能夠增加揮發(fā)油的穩(wěn)定性；膠束是一個透明的熱力學(xué)和動力學(xué)穩(wěn)定體系［8］，揮發(fā)油進(jìn)入到膠束內(nèi)核的疏水性液態(tài)空間，被聚山梨酯-80形成的分子膜包圍，避免了與藥液等外部環(huán)境的直接接觸，從而避免了揮發(fā)油的擴(kuò)散揮發(fā)與氧化。

圖4 膠束中揮發(fā)油在0個月的氣相色譜圖

圖5 膠束中揮發(fā)油在6個月的氣相色譜圖

2.4 “復(fù)方草連”納米注射液對患豬的初步療效由結(jié)果可知，“復(fù)方草連”納米注射液與安乃近用藥3 d后均能有效降低患豬的體溫，改善患豬的臨床癥狀，二者之間無顯著性差異（t-test，P＞0.05），具體見表1，表明“復(fù)方草連”納米注射液具有一定的退熱作用，具體的作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的深入研究。治療3 d后，安乃近組患豬的外周血液CD3+CD4+含量（%）由用藥前的 24.08±2.44降低至18.33±4.18；而“復(fù)方草連”納米注射液組患豬外周血液CD3+CD4+含量（%）由用藥前的23.77±2.66升高至28.59±5.53，且與安乃近組間有顯著的差異（ttest， P ＜0.05），具體見表 2，表明“復(fù)方草連”納米注射液具有一定的提高患豬免疫力的作用。

表1 安乃近與“復(fù)方草連”納米注射液對患豬體溫的影響

表2 安乃近與“復(fù)方草連”納米注射液對患豬CD3+CD4+含量的影響

3 討論

3.1 組方方解與分析 “復(fù)方草連”注射液由老鸛草、連翹、防風(fēng)、柴胡、知母、刺五加等配伍而成，其中老鸛草、連翹具有清熱解毒的功效而為君藥，現(xiàn)代研究表明二者具有廣譜抗菌抗病毒作用，均含有揮發(fā)油類特別是連翹揮發(fā)油的抗菌抗病毒作用優(yōu)于其水溶性成分［11］；防風(fēng)和柴胡具有祛風(fēng)解表、透表泄熱的功效而為臣藥，均含有揮發(fā)油類，可用于感冒發(fā)熱、寒熱往來等，現(xiàn)代研究表明二者具有較好的解熱鎮(zhèn)痛與抗過敏作用；刺五加與知母共為佐藥，刺五加具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神與祛風(fēng)除濕的功效，能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗應(yīng)激能力與免疫力，使機(jī)體能夠耐受各種有害刺激包括物理、化學(xué)與生物應(yīng)激的有害影響［11］，而知母具有清熱瀉火、養(yǎng)陰生津的功效，符合中醫(yī)“清熱需養(yǎng)陰”的理論，可用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳與腸燥便秘等；全方具有“清熱解毒、疏風(fēng)解表、益氣健脾、養(yǎng)陰生津”的功效，對于豬高熱綜合癥具有標(biāo)本兼治的作用。

3.2 制備工藝 傳統(tǒng)的中藥水針劑制備工藝不能有效提取并保留揮發(fā)油類，因而，在一定程度上弱化了中藥的療效。本文在制備工藝上采用了雙提法提取中藥材，同時得到揮發(fā)油與水溶性部位，保持了中草藥多成分、多靶點(diǎn)、多功效的綜合作用特點(diǎn)；采用超濾技術(shù)對藥液進(jìn)行處理，有效除掉了水溶性高分子雜質(zhì)，從而解決了在存儲過程中出現(xiàn)渾濁而引起的澄明度問題；揮發(fā)油納米膠束在制備過程中采用聚山梨酯-80分步加入方式，避免了聚山梨酯-80與藥液中某些雜質(zhì)成分形成沉淀而影響制劑澄明度的弊端［9］；揮發(fā)油進(jìn)入到納米膠束的內(nèi)核而極大地增加了其在水溶液中的溶解度，且被聚山梨酯-80形成的分子膜包圍，避免了擴(kuò)散揮發(fā)與氧化從而提高了穩(wěn)定性。

3.3 藥理功效的探討與展望 長時間與大劑量應(yīng)用激素、解熱鎮(zhèn)痛與抗生素能夠抑制患豬免疫功能、降低抗應(yīng)激能力［12］，在一定程度上促進(jìn)了病毒、細(xì)菌在體內(nèi)的變異與復(fù)制而不利于疾病的治療，而抗生素殘留也限制了我國畜禽產(chǎn)品的出口貿(mào)易。本文初步研究結(jié)果表明“復(fù)方草連”納米注射液具有一定的退熱作用與提高患豬的外周血液T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+含量即免疫力的作用，而免疫力的提高還可以進(jìn)一步增強(qiáng)患豬的抗應(yīng)激能力；這對于疾病具有“標(biāo)本兼治”的作用，但具體的作用機(jī)理與規(guī)律還需要進(jìn)一步的深入研究與探討。另外，“復(fù)方草連”納米注射液為中草藥制劑，其活性成分為天然獲取，具有易代謝、不蓄積與不污染生態(tài)環(huán)境的獨(dú)特優(yōu)勢，符合健康養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢［12］，能夠有效地避免臨床上應(yīng)用激素、解熱鎮(zhèn)痛與抗生素類藥物的弊端與危害，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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