陳慧華，應(yīng)永飛，杜旭奕，羅成江，周芷錦

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州310020）

那西肽（Nosiheptide）是一種含硫多肽類抗生素，其結(jié)構(gòu)式見圖1。那西肽對(duì)畜禽有明顯的促生長(zhǎng)作用，對(duì)環(huán)境影響小、對(duì)人畜安全，且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，目前歐美和日本均已批準(zhǔn)其在畜禽養(yǎng)殖中使用［1-2］。1998年我國(guó)將其批準(zhǔn)為國(guó)家三類新獸藥［3］，被農(nóng)業(yè)部168號(hào)公告列為可在飼料中長(zhǎng)期添加使用的藥物添加劑［4］，已廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。為保障動(dòng)物源性食品的安全性，國(guó)際上紛紛制定了那西肽的殘留限量和檢測(cè)方法，如日本肯定列表制定規(guī)定了雞和豬肌肉、肝臟等組織中那西肽的最高殘留限量均為 30 μg／kg［5］，美國(guó) AOAC 已制定了動(dòng)物組織中那西肽的檢測(cè)方法［6］。由于我國(guó)還未制定動(dòng)物組織中那西肽殘留限量和檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，為完善那西肽安全用藥體系，迫切需要建立動(dòng)物組織中那西肽殘留的檢測(cè)方法。

圖1 那西肽的分子結(jié)構(gòu)式

目前，針對(duì)動(dòng)物組織中那西肽殘留檢測(cè)的研究很少，主要以飼料和獸藥檢測(cè)為主，包括微生物檢定法［3］、氣質(zhì)聯(lián)用法［7］和液相色譜法［3，6，8-9］，其中氣質(zhì)聯(lián)用法需要進(jìn)行衍生化等復(fù)雜前處理；液相色譜法不需要進(jìn)行衍生化處理，操作更為簡(jiǎn)便。近年來(lái)，QuEChERS檢測(cè)技術(shù)以其快速、簡(jiǎn)易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全等特點(diǎn)在農(nóng)、獸藥殘留和霉菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［10-11］，本文研究采用QuEChERS前處理方法，結(jié)合高效液相色譜熒光檢測(cè)法，建立了動(dòng)物組織中那西肽殘留量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀-2475熒光檢測(cè)器，配 Empower 2軟件，美國(guó) Waters公司；METTLER TOLEDOXS-205電子天平（感量0.01 mg）；SL502 N電子天平（感量0.01 g）；KQ-500E型超聲波清洗器；Sigma 3k30型冷凍離心機(jī)；BüCHI B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；AM-6勻漿機(jī)；IKA MS2 minishaker渦旋混勻器。

1.2 試劑 那西肽標(biāo)準(zhǔn)品，由浙江匯能動(dòng)物藥品有限公司提供，純度大于95.0%；無(wú)水硫酸鎂、C18、PSA、GCB均為QuEChERS專用材料，美國(guó)Agilent公司；乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺為色譜純，Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水；磷酸、正丙醇、無(wú)水硫酸鈉等為分析純。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 準(zhǔn)確稱取那西肽標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于25 mL容量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺溶解后稀釋至刻度，配制成濃度為1.0 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；吸取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成含那西肽為 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 和2.0 μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；熒光檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)327 nm，發(fā)射波長(zhǎng)521 nm；流動(dòng)相：0.025%磷酸溶液／乙腈（52：48，V／V）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL／min； 進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.2 樣品前處理 稱?。?±0.05）g試樣于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈，高速勻漿1 min，加入無(wú)水硫酸鈉3 g，中速振蕩提取10 min；于8000 r／min離心5 min，傾出上清液至另一50 mL離心管中，剩余殘?jiān)?0 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次提取上清液；提取液中加入150 mg C18和100 mg無(wú)水硫酸鎂，中速振蕩5 min，于8000 r／min離心5 min，傾出上清液至雞心瓶中，加入5 mL正丙醇，40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；準(zhǔn)確加入2.0 mL流動(dòng)相至雞心瓶中，渦旋混勻1 min溶解殘余物，過(guò)膜后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率 取1.3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，按濃度從低到高依次進(jìn)行高效液相色譜分析，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次。以峰面積y對(duì)濃度x（μg／mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝1691662x－18247，線性相關(guān)系數(shù)r2＝0.9998。結(jié)果表明，那西肽在0.01～2.0 μg／mL的濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 檢測(cè)限和定量限 以豬、雞肌肉和肝臟等典型畜禽產(chǎn)品為樣品基質(zhì)，添加適量那西肽標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行試驗(yàn)，考察方法的檢測(cè)限和定量限。經(jīng)回收率試驗(yàn)，當(dāng)動(dòng)物組織中添加那西肽為5 μg／kg時(shí)，信噪比（S／N）均大于3；當(dāng)動(dòng)物組織中添加那西肽為 10 μg／kg 時(shí)，信噪比（S／N）均大于 10，所以本方法的檢測(cè)限為 5 μg／kg，定量限為 10 μg／kg。 由于那西肽是允許使用的藥物飼料添加劑［4］，且檢測(cè)濃度大大低于日本肯定列表規(guī)定的30 μg／kg的要求［5］，完全能滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 取豬、雞肌肉和肝臟樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，系統(tǒng)考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。 分別進(jìn)行 10、20、100 μg／kg 添加濃度的回收率實(shí)驗(yàn)，每批次同一濃度做5個(gè)平行，每個(gè)濃度重復(fù)3次，分別計(jì)算批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同動(dòng)物組織中那西肽回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

從回收率結(jié)果看出，豬、雞肌肉和肝臟在10～100 μg／kg添加濃度范圍內(nèi)，平均回收率為73.8%～93.0%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.3%～11.1%之間，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.9%～10.9%之間，可見本方法能滿足動(dòng)物組織中那西肽測(cè)定的需要。圖2是添加濃度為20 μg／kg時(shí)，那西肽標(biāo)準(zhǔn)溶液、豬肝空白樣品溶液和豬肝添加樣品溶液高效液相色譜圖，箭頭所示為那西肽峰。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè) 采用建立的檢測(cè)方法對(duì)市場(chǎng)隨機(jī)抽檢的109份豬肝、豬肉、雞肉樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)那西肽陽(yáng)性樣品。

3 討論

3.1 熒光檢測(cè)條件的確定 目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道液相色譜法測(cè)定那西肽的方法中，檢測(cè)器包括紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器兩種。紫外檢測(cè)器主要用于獸藥和飼料樣品含量測(cè)定，波長(zhǎng)包括330 nm［3］和241 nm［9］，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檢測(cè)靈敏度很低，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，無(wú)法滿足藥物殘留檢測(cè)要求。本文參考文獻(xiàn)［6，8］的方法，采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，比較了激發(fā)波長(zhǎng)357 nm、發(fā)射波長(zhǎng)500 nm和激發(fā)波長(zhǎng)327 nm、發(fā)射波長(zhǎng)521 nm兩種檢測(cè)條件，發(fā)現(xiàn)采用后者條件的靈敏度更高，雜質(zhì)干擾更少，因此確定熒光檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)327 nm、發(fā)射波長(zhǎng)521 nm。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）、豬肝空白樣品溶液（B）和豬肝添加樣品溶液（C）高效液相色譜圖

3.2 液相色譜分離條件的確定 由于那西肽屬于含硫多肽類抗生素，極性較弱，可采用C18柱作為分析柱進(jìn)行分離。本研究對(duì)Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱、Waters Atlantis C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱、 Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱等三種規(guī)格的色譜柱進(jìn)行了比較，結(jié)果表明分離結(jié)果均較為滿意。在流動(dòng)相選擇上，比較了磷酸鹽緩沖液／乙腈、磷酸溶液／乙腈和水／乙腈體系的色譜保留性能和靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磷酸溶液／乙腈流動(dòng)相體系那西肽峰型最好、靈敏度最高。進(jìn)一步優(yōu)化磷酸溶液濃度和流動(dòng)相配比，使那西肽獲得最佳峰型和保留時(shí)間，最終確定流動(dòng)相為0.025%磷酸溶液／乙腈為52／48（V／V），流速為 1.0 mL／min。

3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化 那西肽分子量較大，在水、乙醇、丙酮和三氯甲烷中不溶或微溶，同時(shí)考慮到動(dòng)物組織中蛋白質(zhì)、脂肪含量高等特點(diǎn)，本研究采用乙腈作為提取劑，蛋白沉淀效果較為理想，結(jié)合QuEChERS方法對(duì)提取液進(jìn)行了凈化。通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和石墨化炭黑（GCB）對(duì)那西肽吸附能力很強(qiáng)，凈化后回收率都很低，而C18和MgSO4不僅對(duì)雜質(zhì)有一定的吸附能力，且對(duì)那西肽的回收率影響小，優(yōu)化使用量后達(dá)到了較好的效果。

3.4 干擾試驗(yàn) 考察在本文色譜條件下，其他類似藥物對(duì)那西肽分析方法的干擾。以目前養(yǎng)殖環(huán)節(jié)常用多肽類抗生素硫酸粘菌素、恩拉霉素、桿菌肽鋅為代表進(jìn)行干擾試驗(yàn)，采用那西肽色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在該色譜條件下以上化合物均未出現(xiàn)色譜峰。

4 結(jié)論

本文采用QuEChERS樣品前處理-高效液相色譜法建立了動(dòng)物組織中那西肽殘留量的分析方法。該方法采用QuEChERS技術(shù)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，建立了快速、簡(jiǎn)易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全的前處理技術(shù)，并系統(tǒng)考察了液相色譜檢測(cè)條件，提升了檢測(cè)靈敏度。在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下，被測(cè)藥物與雜質(zhì)得到了較好的分離，出峰時(shí)間合適。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法條件易于控制，靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、加標(biāo)回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能夠滿足日常檢測(cè)的要求，適用于動(dòng)物組織中那西肽殘留量的測(cè)定。

［1］沈順新，任銀娥.那西肽對(duì)豬生長(zhǎng)性能的影響［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2008， 35（11）：151-152.

［2］孫小青，宋代軍.那西肽的飼用性質(zhì)及其應(yīng)用［J］.飼料研究， 2007， （12）：36-38.

［3］張秀英，陸連壽，溫 芳，等.高效液相色譜法測(cè)定那西肽的純度［J］.中國(guó)獸藥雜志，2013，47（7）：22-24.

［4］農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部168號(hào)公告飼料藥物添加劑使用規(guī)范［S］.

［5］日本肯定列表制度.Table（1） of item 6 of“Paragraph A：CompositionalStandards for Foods in General” of “ Section I：Foods”； The maximum residue limits of substances used as ingredientsof agricultural chemicals in foods（Provisional MRLs List）.2006.

［6］Horii S， Oku N.Rapid Determination of Nosiheptide in Meat and Egg by Liquid Chromatography with Fluorescence Detection ［J］.Journal of AOAC International， 2000， 83（1）： 17-19.

［7］DB 34／T 1371-2011.動(dòng)物組織中那西肽的殘留測(cè)定-氣相色譜質(zhì)譜法［S］.

［8］翟衛(wèi)紅，沈建忠，江海洋.豬小腸組織中那西肽殘留高效液相色譜檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47（2）：70-71.

［9］段 紅，翟科峰，劉瑞華，等.HPLC測(cè)定那西肽預(yù)混劑中那西肽的含量［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室， 2012，29（2）： 836-839.

［10］Lombardo-Agüí M ， García-Campana A M，Gámiz-Gracia L， et al.Determination of quinolones of veterinary use in bee products by ultra-high performance liquid chromato graphy-tandem mass spectrometry using a QuEChERS extraction procedure［J］.Talanta， 2012，93：193-199.

［11］Frenich A G， Romero-González R， Gómez-Pére M L.Multimycotoxin analysis in eggs using a QuEChERS-based extraction procedure and ultra-high-pressure liquid chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A， 2011， 1218（28）： 4349-4356.