張亞平，張桂君，徐立蕭，張 怡，楊海翠，鄭建龍，方炳虎

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510000）

乙酰甲喹（又名痢菌凈，MEQ），化學(xué)名3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物，屬于喹噁啉類(lèi)衍生物。乙酰甲喹具有廣譜抗菌性，抗菌效果顯著，對(duì)密螺旋體有特效，又因其價(jià)格低廉使用方便，被廣泛用于畜禽業(yè)中腸道疾病的治療。我國(guó)尚未制定乙酰甲喹的休藥期和最高殘留限量（MRL），近年來(lái)由于乙酰甲喹的不合理應(yīng)用，導(dǎo)致中毒事件時(shí)有發(fā)生［1-3］，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，也給人類(lèi)健康帶來(lái)潛在威脅。本文旨在應(yīng)用HPLC-MS／MS法，對(duì)乙酰甲喹及其6種主要代謝物，脫二氧乙酰甲喹（M1）、N1-脫氧乙酰甲喹（M2）、N1-脫氧側(cè)鏈羰基還原乙酰甲喹（M4）、脫二氧側(cè)鏈羰基還原乙酰甲喹（M5）、側(cè)鏈羰基還原乙酰甲喹（M6）和羰基還原羥化乙酰甲喹（M7）在雞體內(nèi)的殘留消除規(guī)律進(jìn)行研究，以期為乙酰甲喹的合理應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 65只健康白羽雞（AV500），采購(gòu)于增城市某養(yǎng)殖廠。

1.1.2 藥物與試劑 乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)品（99.6%，HO111008），來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。M1（98%）、M2（95%）、M4（95%）、M5（97%）和 M6（97%）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供。M7（97%）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院合成而來(lái)。色譜級(jí)甲醇、乙腈和甲酸，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；分析純鹽酸，購(gòu)自衡陽(yáng)化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（Millipore-Q系統(tǒng)）。

1.1.3 儀器設(shè)備 美國(guó)Agilent公司1200型液相色譜儀串聯(lián)美國(guó)ABI公司API 4000四極桿質(zhì)譜儀；5804（R）型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；T25型高速組織勻漿器，德國(guó) IKA公司；HS501 digital型軌道式搖床，德國(guó) IKA公司；Wat200609固相萃取裝置，美國(guó)Waters公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；OasisHLB固相萃取小柱（60 mg， 3cc），美國(guó) Waters公司；0.22 μm有機(jī)相濾膜，天津津騰試驗(yàn)儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物試驗(yàn) 65只雞分為試驗(yàn)組（55只）和對(duì)照組（10只），給藥前適應(yīng)一周后，試驗(yàn)組以20 mg／kg體重灌服乙酰甲喹懸濁液，一天兩次，連續(xù)三天。給藥結(jié)束后宰殺空白組，并在 2、4、6、12、16、24、30、36、48、72和120 h分別宰殺5只試驗(yàn)組雞（隨機(jī)選取）。宰殺前翅下靜脈采血，置于含肝素的離心管中，3000 r／min離心10 min后，取上清，-20℃冰箱儲(chǔ)存。宰殺后，每只雞均取肌肉、皮脂、肝臟和腎臟組織，均質(zhì)后-20℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.2 樣品前處理 血漿樣品處理：取0.5 mL血漿，加入0.5 mL乙腈，充分渦旋30～60 s，置于高速離心機(jī)中 15000 r／min，20 min，4 ℃。 離心后取上清，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜后裝進(jìn)樣瓶，待測(cè)。

組織樣品處理：該方法優(yōu)化自Zeng等［4］，稱(chēng)取（2.00 ± 0.02）g組織，加入12 mL濃度為2 mol／L的鹽酸溶液，充分渦旋后，置于60℃水浴鍋中，水浴1 h。 水浴后，326 mot／min 震蕩 15 min，10000 r／min離心10 min，取上清再次離心10000 r／min，10 min 后取6 mL上清。開(kāi)始過(guò)HLB柱，3 mL甲醇活化，3 mL水平衡，然后上樣液，再 3 mL甲醇水（5：95 V／V）淋洗，最后3 mL甲醇洗脫。取1 mL洗脫液過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜后裝進(jìn)樣瓶，待測(cè)。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為CNW C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為色譜乙腈，梯度洗脫條件見(jiàn)表1，進(jìn)樣量為5 μL。

表1 梯度洗脫條件表

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI+）；離子噴霧電壓（IS），4500 V；離子源溫度（TEM），維持在650 ℃；碰撞氣 （CAD），5 psi；離子源 GS1，55 psi；離子源 GS2，50 psi；氣簾氣（CUR），20 psi；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），離子參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜分析中的離子參數(shù)

1.2.5 基質(zhì)校準(zhǔn) 稱(chēng)取適量的乙酰甲喹及其6種代謝物溶于甲醇，配制成20、10、1、0.1 mg／mL 的儲(chǔ)備液，并用儲(chǔ)備液配成兩個(gè)系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液：系列1為0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 和 20 mg／mL；系列 2 為0.01、0.02、0.04、0.1、0.5、1、2、5、10 和20 mg／mL。 檢測(cè)時(shí)采用基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線，取980 μL空白基質(zhì)添加20 μL混和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制而成。血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線為2、4、20、40、80、200、400 和800 ng／mL 系列濃度，組織標(biāo)準(zhǔn)曲線為0.6、1.2、2.4、6、30、60、120、300、600 和 1200 ng／g 系列濃度。

1.2.6 方法驗(yàn)證 在 5、20 和 200 ng／g（ng／mL）三個(gè)添加濃度下，每個(gè)濃度5個(gè)平行，測(cè)3批，考察乙酰甲喹及其主要代謝物在雞肌肉、皮脂、肝臟、腎臟和血漿中的回收率和精密度。

1.2.7 樣品測(cè)定 對(duì)于預(yù)試驗(yàn)中濃度比較高的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)樣品，在正式試驗(yàn)中樣品稀釋后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用Analyst1.5軟件測(cè)算藥物濃度，WinNonlin5.2.1軟件中的非房室模型計(jì)算血漿和各組織中乙酰甲喹及其6種代謝物的消除參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 方法考察結(jié)果 建立的HPLC-MS／MS方法，靈敏度高，乙酰甲喹及其6種代謝物在雞可食性組織和血漿中的檢測(cè)限（LOD）不超過(guò)2 ng／g，定量限（LOQ）不超過(guò)5 ng／g，詳見(jiàn)表3?；|(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好（表4）。在三個(gè)批次三個(gè)添加濃度下，回收率為67.4%～106.1%（表5），批內(nèi)變異系數(shù)為4.6%～13.7%，批間變異系數(shù)低于15%（表6），說(shuō)明該方法符合殘留檢測(cè)要求。

表3 乙酰甲喹及其6種代謝物的檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）

表4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

表5 在5、20、200 ng／g（ng／mL）三個(gè)添加水平下乙酰甲喹及其6種代謝物在雞可食性組織和血漿中的回收率 %

表6 在5、20、200 ng／g（ng／mL）三個(gè)添加水平下乙酰甲喹及其6種代謝物在雞可食性組織和血漿中的變異系數(shù) %

2.2 樣品檢測(cè)結(jié)果 乙酰甲喹在雞組織和血漿中消除迅速，僅在皮脂和血漿中檢測(cè)到少量，其代謝物廣泛分布，代謝物的的主要?dú)埩粝齾?shù)見(jiàn)表7。總體而言，代謝物在肌肉和肝臟中殘留量較多，肝臟中M4的曲線下面積（AUC）最大，達(dá)70524.62 h·ng／g。 數(shù)據(jù)表明M6和M7在皮脂中的殘留時(shí)間最長(zhǎng)，平均滯留時(shí)間（MRT）分別為16.3595 h和41.3446 h。給藥后120 h，已基本檢測(cè)不到代謝物。

3 討論

試驗(yàn)所建立的乙酰甲喹及其6種代謝物在雞可食性組織和血漿中的殘留檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好，符合殘留檢測(cè)要求。已發(fā)表的研究表明［4-6］，乙酰甲喹在雞、綿羊和豬血漿中的消除半衰期（t1／2）較短，消除迅速，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。Zeng等在研究乙酰甲喹及其5種代謝物（M1，M2，M4， M5和 M6）在豬體內(nèi)的殘留時(shí)發(fā)現(xiàn)，肝臟中殘留量最高的代謝物為M1，與本文結(jié)果（肝臟中殘留最多的為M4）存在差異，主要原因可能是由于種屬差異。在同屬喹噁啉類(lèi)藥物的喹賽多和喹烯酮的殘留研究中表明［7-9］，肝臟是殘留時(shí)間最長(zhǎng)的組織，本研究數(shù)據(jù)顯示皮脂是乙酰甲喹代謝物滯留時(shí)間最長(zhǎng)的組織，推測(cè)乙酰甲喹的殘留消除有其特異性。

表7 乙酰甲喹及其6種代謝物在雞可食性組織和血漿中的主要?dú)埩粝齾?shù)

乙酰甲喹的代謝物較原藥在雞體內(nèi)殘留時(shí)間長(zhǎng)和殘留量高，殘留消除過(guò)程也較為復(fù)雜，表明代謝物在殘留研究中的重要價(jià)值，然而目前的相關(guān)研究主要集中在乙酰甲喹原藥，代謝物的研究有待深入。

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