韓 立，班付國，周紅霞，王 林，劉素梅，張躍京

(1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008;2.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，鄭州451464)

板藍(lán)根注射液為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis Indigotica Fort.)的干燥根，以水提醇沉法提取后制成的滅菌水溶液。作為一種清熱解毒、涼血利咽的中獸藥注射液，它具有抗菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素、增強(qiáng)免疫的作用，尤其在抗病毒方面療效確切［1－2］，用于治療家畜流感、仔豬白痢、肺炎及某些發(fā)熱性疾病。板藍(lán)根注射液的成分復(fù)雜多樣，主要有靛藍(lán)、靛玉紅、(R，S)－告依春、多種有機(jī)酸、核苷、氨基酸等多種成分［3－4］。以往報道的含量測定方法多為測定板藍(lán)根注射液中靛藍(lán)、靛玉紅、有機(jī)酸、氨基酸的含量［5－7］，但該制劑為水煎提取液，靛藍(lán)、靛玉紅為脂溶性，在水提液中溶解性小，因此難以作為含量控制指標(biāo)。(R，S)－告依春為主要抗病毒活性成分，又為水溶性，因此有必要建立板藍(lán)根注射液中(R，S)－告依春的含量測定方法，用以控制板藍(lán)根注射液的含量。

1 儀器與試劑

Waters超高效液相色譜儀(美國Waters公司)配置TUV紫外檢測器檢測器，Empower2色譜工作站采集數(shù)據(jù)。電子天平(BP211D)，德國Sartorius公司。超純水裝置，Milli－Q Advantage A10，美國密理博公司。

甲醇(色譜純)，磷酸(分析純)，中性氧化鋁(層析用)，純化水，(R，S)－告依春對照品(含量99.9%，批號110713－200911，中國藥品生物制品檢定所)。板藍(lán)根注射液樣品6批(批號分別為20130701， 20130702， 20130703， 20130501，20130502，20130503，均由 1家獸藥生產(chǎn)企業(yè)提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 流動相為甲醇－0.02%磷酸溶液(7:93);色譜柱:Waters XBridge C18，150 mm ×4.6 mm，5 μm;檢測波長 245 nm;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫30 ℃。理論板數(shù)按R，S－告依春峰計算不低于2400，主峰的保留時間約為12 min。結(jié)果見圖1、圖2。結(jié)果表明在上述色譜條件下板藍(lán)根注射液分離效果好，R，S－告依春和其他組分達(dá)到基線分離。

圖1 對照品色譜圖

圖2 板藍(lán)根注射液色譜圖

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取(R，S)－告依春對照品10.36 mg，置250 mL量瓶中，加甲醇制成每 mL 含41.4 μg 的溶液，過 0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取板藍(lán)根注射液5 mL，過中性氧化鋁柱(內(nèi)徑為1.5 cm，5 g)，收集流出液，再用15 mL水洗脫，流出液和洗脫液合并至25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 取R，S－告依春對照品溶液，分別稀釋成 1、5、10、20、40 μg/mL，精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為:y ＝ 77327x+519.2，相關(guān)系數(shù) r＝ 0.9998，在1～40μg/mL的濃度范圍內(nèi)，對照品具有良好的線性關(guān)系(圖3)。

圖3 R，S-告依春標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 精密度試驗 精密吸取(R，S)－告依春對照溶液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣6次測定峰面積。結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.31%，表明系統(tǒng)精密度符合要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，分別在樣品處理后的 0，1，2，8，12 h 進(jìn)樣，測定峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。結(jié)果在12 h內(nèi)含量下降率僅為0.13%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取批號為20130701的板藍(lán)根注射液，精密量取5 mL，共6份，分別按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下條件進(jìn)樣測定，計算含量及RSD。結(jié)果樣品中(R，S)－告依春的含量為 37.8 μg/mL，RSD 為 0.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗 取批號為20130701的板藍(lán)根注射液，精密量取2.5 mL，共6份，用移液槍分別加入0.4 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.236 mL(相當(dāng)于約94.5 μg的(R，S)－告依春)，按照 2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下條件測定，計算平均回收率及RSD，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，該方法平均回收率為98.6%，RSD為0.36%，說明方法的回收率較高，重復(fù)性良好。

2.9 樣品的測定 取同一公司5批板藍(lán)根注射液樣品，每批量取兩份，按供試品處理方法處理。取10 μL樣品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，平行進(jìn)樣兩次，計算平均含量。各批次樣品的含量見表2。結(jié)果表明5批板藍(lán)根注射液含板藍(lán)根以(R，S)－告依春計，在36.2 ～42.5 μg/mL 之間。

表1 (R，S)-告依春回收率試驗結(jié)果

表2 樣品測定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 樣品提取方法的選擇 板藍(lán)根注射液為板藍(lán)根水浸出物的滅菌水溶液，主要工藝為加水煎煮，濃縮，醇沉之后加水定容，每1 mL相當(dāng)于0.5 g原生藥。(R，S)－告依春溶于三氯甲烷、乙醇、甲醇，也能溶于沸水，不溶于冷水。試驗分別比較了甲醇、70%甲醇、30%甲醇、純水作為溶劑進(jìn)行稀釋提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)室溫條件下(20～25℃)用純水提取的回收率最高，而用10℃以下的冷水提取時回收率有明顯下降，這與石燕紅［8］的結(jié)論相符。因此，試驗選用純水在室溫條件下提取?？紤]到(R，S)－告依春在冷水中溶解度很小，應(yīng)盡量避免使用冷水提取。

3.2 樣品的凈化 試驗比較了樣品過中性氧化鋁柱和不過中性氧化鋁柱的效果。發(fā)現(xiàn)不過中性氧化鋁柱時，供試品溶液顏色較深，進(jìn)樣后雜質(zhì)峰較多，很難與目的峰分離。當(dāng)樣品過中性氧化鋁柱后，供試品溶液顏色變淺，雜質(zhì)峰明顯減少，樣品的含量幾乎沒有變化?？梢酝茢啵氐入s質(zhì)被中性氧化鋁吸附，但(R，S)－告依春基本都被洗脫下來。

3.3 樣品的含量 試驗考察了同一公司6批樣品，(R，S)－ 告依春含量范圍為 36.2 ～42.5 μg/mL。由于藥材來源不同，不同公司的生產(chǎn)工藝存在差異，板藍(lán)根注射液中(R，S)－告依春含量相差可能較大［9］。參照《中華人民共和國藥典》板藍(lán)根和《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)》(化學(xué)藥品、中藥卷)板藍(lán)根注射液有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［10－11］，有必要對板藍(lán)根注射液成品中(R，S)－告依春的收率以及不同來源的板藍(lán)根注射液中(R，S)－告依春含量進(jìn)行進(jìn)一步的測定和考察，以制定出合理的含量限度。

3.4 方法的評價 現(xiàn)有文獻(xiàn)報道了幾種不同的高效液相色譜流動相條件對(R，S)－告依春進(jìn)行含量測定，主要包括乙腈－磷酸水系統(tǒng)［12］、乙腈－冰乙酸水系統(tǒng)［13］等流動相系統(tǒng)，試驗對這幾種方法分別進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)采用甲醇－0.02%磷酸水溶液(7∶93)流動相系統(tǒng)效果最好，方法學(xué)考察均符合要求。

3.5 小結(jié) 試驗建立了板藍(lán)根注射液中(R，S)－告依春含量測定的高效液相色譜方法。該方法簡單快速，靈敏度高，重復(fù)性好，可以有效控制板藍(lán)根注射液中(R，S)－告依春的含量，并為板藍(lán)根注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

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