裴保河
(鶴壁市疾病預(yù)防控制中心,河南 鶴壁 458030)
冬凌草(Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara)又名冰凌草、延命草、彩花草等,為唇形科香茶屬多年生草本或亞灌木,自然分布于太行山南部。自古以來被太行山區(qū)的民間常年當(dāng)作茶葉飲用。因其清熱解毒、清咽利喉、消止痛的功能盛行于當(dāng)?shù)?,被譽(yù)為“神奇草”。1972年,中國(guó)食管癌研究中心,發(fā)現(xiàn)冬凌草具有獨(dú)特的抗食管癌,賁門癌、原發(fā)性肝癌功效,從此被廣泛應(yīng)用于臨床[1]。進(jìn)入21世紀(jì)以來,國(guó)際腫瘤病學(xué)界和新藥研發(fā)機(jī)構(gòu)對(duì)冬凌草的抗癌作用格外關(guān)注,其化學(xué)成分及藥理活性研究取得較大進(jìn)展[2],從全株植物分離得到大量二萜類化合物、一些三萜、甾體、黃酮、生物堿、揮發(fā)油、氨基酸、有機(jī)酸及其他類化合物[3]。藥理研究表明,多個(gè)成分具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎、降血糖、抗突變、免疫等活性[4-8]。冬凌草中的主要三萜類成分熊果酸具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[9]。研究表明[10],熊果酸不僅對(duì)多種致癌、促癌物有抵抗作用,而且對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)作用。因此提取冬凌草中熊果酸成分,開發(fā)新藥及保健食品具有廣闊的前景。
目前,關(guān)于冬凌草中冬凌草甲素等二萜類化合物提取研究較多[11],但有關(guān)冬凌草中熊果酸的提取報(bào)道較少,袁珂[12]采用超臨界二氧化碳技術(shù)萃取冬凌草中熊果酸,得率較高,但該法時(shí)間較長(zhǎng)。超高壓提取技術(shù)是在常溫條件下提取植物原料中有效成分,提取時(shí)間短、能耗低、有效成分破壞小[13],目前在冬凌草中熊果酸的提取上還未見報(bào)道。本文研究超高壓提取冬凌草中熊果酸的工藝條件,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝,為冬凌草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。
1.1 試驗(yàn)材料 2012年6月在鶴壁市食品藥品監(jiān)督管理局檢驗(yàn)中心進(jìn)行試驗(yàn)。冬凌草,采自河南省鶴壁市淇河岸邊,新鮮成熟植株地上部分→70℃烘干→粉碎→20目過篩→真空包裝→備用;熊果酸對(duì)照品,中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙醇試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
SFP超高壓處理系統(tǒng),英國(guó)SFP公司;XH-600US超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,廣州市捷晶能源科技有限公司;Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng),Agilent公司。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 超高壓提取冬凌草中熊果酸 在冬凌草粗粉中,加入不同體積、不同濃度的乙醇溶液,混合均勻后裝入聚乙烯塑料袋,進(jìn)行真空包裝,然后放入超高壓裝置的壓力腔中,高壓處理一定時(shí)間,處理后過濾,3 500 r/min離心15 min,離心后減壓濃縮,測(cè)定熊果酸含量,計(jì)算熊果酸的得率。
1.2.2 回流提取冬凌草中熊果酸 在冬凌草粗粉中,按固液比1∶20(g:mL)加入75%乙醇溶液,加熱回流2 h。過濾,3 500 r/min離心15 min,離心后減壓濃縮,測(cè)定熊果酸含量,計(jì)算熊果酸的得率。
1.2.3 超聲提取冬凌草中熊果酸 在冬凌草粗粉中,按固液比1∶20(g:mL)加入75%乙醇溶液,采用220 W超聲處理30 min,過濾,3 500 r/min離心15 min,離心后減壓濃縮,測(cè)定熊果酸含量,計(jì)算熊果酸的得率。
1.2.4 熊果酸的HPLC測(cè)定 參照HPLC方法測(cè)定熊果酸[14],色譜柱(Phenomsil BDS C18,4.6 mm×200 mm,5μm),流動(dòng)相:CH3OH:H2O:HAc為85∶15∶0.3,流速:1 mL/min,柱溫:35℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。峰面積A與熊果酸濃度C(mg/mL)之間的回歸方程為A=381.63C-3.0644(R2=0.9996)。
2.1 超高壓提取冬凌草中熊果酸單因素實(shí)驗(yàn)
2.1.1 固液比對(duì)熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑,UHP壓力350 M下保壓4 min進(jìn)行提取,不同固液比對(duì)熊果酸提取得率的影響見圖1。
由圖1可見,隨著固液比中溶劑用量的增加,熊果酸的提取得率增加,但當(dāng)固液比達(dá)到1∶20(g:mL)后,再增加溶劑用量,得率增加緩慢。同時(shí),過多的溶劑用量會(huì)帶來后續(xù)濃縮的強(qiáng)度增加,因此,綜合考慮,采用固液比1∶20較好。
2.1.2 乙醇濃度對(duì)熊果酸提取得率的影響 采用不同濃度的乙醇溶液為溶劑,固液比1∶20(g:mL),UPH壓力350 M下保壓4 min進(jìn)行提取,乙醇濃度對(duì)熊果酸提取得率的影響見圖2。
由圖2可見,隨著乙醇濃度的增加,熊果酸的提取得率增加,但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%后,再增加乙醇濃度,得率反而下降。
2.1.3 UHP壓力對(duì)熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑,固液比1∶20(g:mL),在不同的UHP壓力下保壓4 min進(jìn)行提取,UHP壓力對(duì)熊果酸提取得率的影響見圖3。
由圖3可見,隨著UHP壓力的增加,熊果酸的提取得率增加,但當(dāng)UHP壓力達(dá)到300 MPa后,再增加壓力,得率反而下降。因此,采用300 MPa提取熊果酸較好。
2.1.4 保壓時(shí)間對(duì)熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑,固液比1∶20(g:mL),在UHP壓力300 MPa下保壓不同時(shí)間進(jìn)行提取,保壓時(shí)間對(duì)熊果酸提取得率的影響見圖4。
由圖4可見,隨著UHP時(shí)間的增加,提取得率增加,但當(dāng)UHP時(shí)間達(dá)到4 min后,再增加時(shí)間,得率增加緩慢。因此,采用4 min提取熊果酸較好。
2.2 提取工藝條件的優(yōu)化 在單因素的基礎(chǔ)上,選用L9(34)正交試驗(yàn)表,以熊果酸得率為指標(biāo),考察固液比、乙醇濃度、UHP壓力、UHP時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響,試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分別見表1和表2。
表1 因素與水平
表2 正交試驗(yàn)
由表2極差分析結(jié)果可知,各因素對(duì)熊果酸得率的影響程度依次為:D>C>B>A,即:UHP時(shí)間>UHP壓力>乙醇濃度>固液比。優(yōu)化的提取條件為 A3B3C3D2,即:UHP時(shí)間4 min、UHP壓力320 MPa、乙醇濃度75%、固液比1∶22。采用冬凌草2 kg,按上述最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),熊果酸得率為0.322%。
2.3 不同提取方法提取熊果酸的比較 將冬凌草分別采用超高壓提取、回流提取和超聲方法進(jìn)行提取,比較提取后熊果酸得率和提取所用的時(shí)間,結(jié)果見表3。
表3 3種方法提取冬凌草中熊果酸的得率和提取時(shí)間
從表3中可見,3種不同的提取方法中,超高壓提取不僅得率高,而且提取時(shí)間短。
冬凌草是一種資源豐富的藥食兩用的植物資源,是開發(fā)保健食品的較好原料,為有效對(duì)其利用,對(duì)其活性成分熊果酸的分離提純藥理學(xué)進(jìn)行深入研究,開發(fā)精制、深加工轉(zhuǎn)化產(chǎn)品是其發(fā)展方向。
目前熊果酸最常用的方法是回流法,該法對(duì)設(shè)備條件要求不高,操作方法簡(jiǎn)單,但熊果酸提取率不高,且提取時(shí)間長(zhǎng);通過采用超聲強(qiáng)化提取可提高得率,縮短時(shí)間,但超聲容易造成有效成分的破壞,且提取仍然需要30 min以上;超微粉碎方法通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壞,提高提取得率,但其對(duì)細(xì)胞的破壞程度有限,得率還有待提高。本研究采用超高壓提取,是通過加壓破壞冬凌草的細(xì)胞,促進(jìn)熊果酸溶出。在提取過程中,細(xì)胞在壓力作用下破壞,但由于為非熱提取,熊果酸破壞小,且提取工藝中,細(xì)胞在幾分鐘內(nèi)即破壞,提取時(shí)間大大縮短,得率得到提高。
采用超高壓提取冬凌草中熊果酸的優(yōu)化工藝條件為固液比1∶22、乙醇濃度75%、UHP時(shí)間4 min和UHP壓力320MPa,熊果酸得率可達(dá)0.322%,具有時(shí)間短,得率高的特點(diǎn),在提取冬凌草中熊果酸中具有很好的應(yīng)用前景。
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