張自強(qiáng)，劉玉梅，位 蘭，朱雪敏，李夢(mèng)云，司麗芳，李 健

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003）

力克斯兔是一種典型的皮肉兼用兔，其皮具有絨毛短、被毛濃密、質(zhì)地柔軟、平整、輕便、美觀、牢固等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高，是裘皮工業(yè)的重要原料之一。但是在養(yǎng)殖過程中，由于營(yíng)養(yǎng)、疾病、創(chuàng)傷或其他原因，力克斯兔的皮膚發(fā)育極易受到內(nèi)外環(huán)境的影響，進(jìn)而影響到兔皮的質(zhì)量。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于力克斯兔生產(chǎn)性能的研究多集中在皮毛性狀分析、遺傳育種改良等方面[1]；對(duì)力克斯兔皮膚疾病的鑒別診斷也多停留在臨床癥狀、大體解剖層面[2]，而關(guān)于不同發(fā)育時(shí)期力克斯兔的皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)毛囊組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)選用不同胎齡和出生后不同發(fā)育時(shí)期的力克斯兔的皮膚作為研究對(duì)象，石蠟切片后H.E.染色，觀察力克斯兔的皮膚從胚胎后期到出生后的生長(zhǎng)發(fā)育過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，研究力克斯兔的皮膚及毛囊的發(fā)育規(guī)律，以期為力克斯兔的飼養(yǎng)、疾病的防治和生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑 蘇木精、伊紅、多聚甲醛、無(wú)水乙醇、0.5%鹽酸酒精分化液、二甲苯，中性樹膠、石蠟。

1.2 試驗(yàn)儀器 KD-BM生物組織包埋機(jī)（科迪），RM2016切片機(jī)（LEICA），KD-T電腦生物組織烤片機(jī)（科迪），顯微鏡（Olympus）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 力克斯兔由河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院試驗(yàn)中心提供。妊娠20、26、29 d、出生后1、15、30、60、90 d的力克斯兔各6只。

1.4 標(biāo)本的采集與固定 將妊娠20、26 d和29 d的雌兔處死，分別解剖取出胚胎，然后對(duì)各個(gè)時(shí)期的胚胎用多聚甲醛進(jìn)行整體固定。48 h后再分別從各個(gè)時(shí)期的胎兔背部取下1 cm2大小的皮膚組織，轉(zhuǎn)入Bousin固定液中固定，以備試驗(yàn)所用。出生后的利克斯兔取材，分別在出生1、15、30、60 d和90 d力克斯兔的皮膚背部選取一塊4 cm2大小皮膚塊并用Na2S脫毛劑脫毛，然后再分別取下一塊2 cm2大小的皮膚，立即放入Bousin固定液中進(jìn)行固定。

1.5 不同發(fā)育時(shí)期八點(diǎn)黑力克斯兔皮膚組織切片的制作及H.E.染色 固定的材料分別經(jīng)梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚7 μm，切片隔5取1，50℃溫箱拷片，備染。H.E.染色方法：將制備好的切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各脫蠟5 min，依次入梯度酒精復(fù)水，蒸餾水浸洗5 min；入蘇木精染色液5～10 min；1%鹽酸酒精分化20～40 s，流動(dòng)自來水中藍(lán)化20～30 min；伊紅染色2～3 min；梯度酒精脫水；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 胎兒期力克斯兔的皮膚組織形態(tài)特點(diǎn) 胚胎20 d（圖1、圖2）力克斯兔的皮膚表面平整，皮膚的發(fā)育已經(jīng)出現(xiàn)表皮和真皮結(jié)構(gòu)，表皮為單層或雙層立方上皮，與真皮間有明顯的界限。初級(jí)毛囊原基出現(xiàn)，真皮細(xì)胞排列疏松，為星狀原始間充質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙較大且真皮內(nèi)出現(xiàn)毛細(xì)血管，真皮厚度明顯大于表皮厚度。

胚胎26 d（圖3、圖4）皮膚進(jìn)一步發(fā)育，表面平整，表皮由單層立方變?yōu)閺?fù)層扁平，表皮和真皮之間初步形成凸凹相間的形態(tài)結(jié)構(gòu)，真皮乳頭層出現(xiàn)，毛囊初步形成，真皮內(nèi)梭形細(xì)胞進(jìn)一步增加排列較疏松，真皮層變厚。

胚胎29 d（圖5、圖6）隨著胎齡的延長(zhǎng)，表皮分化明顯，角質(zhì)層增厚，真皮層內(nèi)疏松結(jié)締組織不斷增殖出現(xiàn)大量膠原纖維，其結(jié)締組織中的細(xì)胞數(shù)量減少，原始毛囊（初級(jí)毛囊）延長(zhǎng)斜向下生長(zhǎng)形成柄棒狀結(jié)構(gòu)，次級(jí)毛囊進(jìn)入真皮層形成管狀鞘囊。在真皮層內(nèi)可見初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊，兩者數(shù)目相當(dāng)。皮膚內(nèi)未見到發(fā)育中的汗腺和立毛肌。

2.2 出生后不同時(shí)期力克斯兔的皮膚組織形態(tài)特點(diǎn) 出生后1 d（圖7、圖8）真皮層可觀察到許多棒狀毛囊，并有毛干形成，毛干開始長(zhǎng)出皮膚表面。初級(jí)毛囊根部膨大形成毛球，毛球的基部出現(xiàn)內(nèi)凹，周圍的成纖維細(xì)胞和結(jié)締組織向內(nèi)遷入形成毛乳頭，次級(jí)毛囊數(shù)目增多。表皮層中基層、棘層、顆粒層和角化層的分化完成，角化層變得更厚。真皮網(wǎng)狀層增厚,膠原纖維束排列成為不規(guī)則致密結(jié)締組織，此時(shí)力克斯兔的皮膚組織結(jié)構(gòu)特征接近成熟。

出生后15 d（圖9、圖10）可見表皮基底層為一層排列緊密呈立方狀的細(xì)胞。棘細(xì)胞層為2～3層呈不規(guī)則或多邊形細(xì)胞，比基底層細(xì)胞大，核呈圓形較大、染色較淺。顆粒層細(xì)胞由1～2層梭形細(xì)胞組成。角化層是由扁平狀細(xì)胞構(gòu)成。初級(jí)毛囊的毛球上皮細(xì)胞已經(jīng)分化為外根鞘和內(nèi)根鞘的結(jié)構(gòu)，次級(jí)毛囊發(fā)育成熟，密度進(jìn)一步增大。

出生后30 d（圖11、圖12）皮膚中表皮和真皮進(jìn)一步增厚，角質(zhì)層更加明顯，可看到薄層皮下組織。毛干成簇分布，一般4～7根為一簇。

出生后60 d（圖13）皮膚的厚度基本不變，但角質(zhì)層和皮下組織變厚。此時(shí)可見次級(jí)毛干數(shù)目大于初級(jí)毛干數(shù)目。

出生后90 d（圖14）此時(shí)皮膚厚度基本保持不變，次級(jí)毛囊密度進(jìn)一步增大，皮膚發(fā)育接近完善。

3 討論

皮膚在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和預(yù)防外來物入侵中發(fā)揮重要的作用。對(duì)于皮毛用動(dòng)物而言,其皮毛有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為了能更好的利用皮毛動(dòng)物的皮和毛，科研工作者對(duì)常見的皮毛動(dòng)物的皮膚及毛囊的發(fā)育過程和特點(diǎn)進(jìn)行了大量的研究，如：Parry等研究了澳大利亞絨山羊出生后皮膚及毛囊的發(fā)育規(guī)律[3]；林吉茂等人研究了我國(guó)關(guān)中奶山羊胎兒皮膚發(fā)育的組織形態(tài)特點(diǎn)[4]；王博等人描述了小鼠皮膚及其毛囊早期發(fā)育的組織形態(tài)變化[5]。但是這些研究對(duì)象多集中在山羊、綿羊和模式動(dòng)物小鼠上。力克斯兔作為皮肉兼用兔，其兔皮用途日益廣泛，目前對(duì)不同發(fā)育時(shí)期力克斯兔的皮膚及毛囊形態(tài)變化研究報(bào)道較少。本研究顯示，力克斯兔的皮膚和其他動(dòng)物的一樣都是由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成，其真皮乳頭層發(fā)達(dá)，由平行排列的膠原纖維束構(gòu)成。胚胎20 d的皮膚表皮細(xì)胞為單層或雙層立方上皮，與真皮細(xì)胞間的界限明顯，真皮內(nèi)出現(xiàn)大量發(fā)育中的毛細(xì)血管，此時(shí)初級(jí)毛囊的原基出現(xiàn)。本研究觀察到的表皮細(xì)胞和毛囊的原基的形成時(shí)間與趙玲輝[6]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，但后者并未提及毛細(xì)血管的出現(xiàn)。胚胎26 d時(shí)表皮的單層立方上皮變?yōu)閺?fù)層扁平上皮，真皮內(nèi)出現(xiàn)乳頭層，初級(jí)毛囊初步形成。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉立群[7]研究相似，但我們的結(jié)果顯示26 d時(shí)皮膚內(nèi)沒有形成較完整的初級(jí)毛囊結(jié)構(gòu)，也未見到汗腺的前體結(jié)構(gòu)。胚胎29 d時(shí)，表皮角化層變厚，乳頭層明顯，可見分化的次級(jí)毛囊形成，皮膚進(jìn)一步變厚。周勤飛[8]和伊俊[9]認(rèn)為毛囊的形成是真皮成纖維細(xì)胞凝集后產(chǎn)生的趨化因子和調(diào)節(jié)因子誘導(dǎo)表皮細(xì)胞增生分化而形成初級(jí)毛囊，正在發(fā)育的初級(jí)毛囊靠近表皮的部分形成分支后再發(fā)育成次級(jí)毛囊。出生后1 d，力克斯兔的皮膚表皮的各層細(xì)胞基本發(fā)育完成，大多數(shù)初級(jí)毛囊和一部分次級(jí)毛囊發(fā)育基本成熟，毛囊的大小和毛干的粗細(xì)繼續(xù)發(fā)育但不會(huì)再有新的毛囊發(fā)生[10-11]。出生后15 d到出生后60 d初級(jí)毛囊密度和次級(jí)毛囊密度均在逐漸增加，但次級(jí)毛囊密度的增長(zhǎng)速度大于初級(jí)毛囊。出生90 d時(shí)初級(jí)毛囊密度降低，次級(jí)毛囊密度增高，毛囊發(fā)育趨于穩(wěn)定。

由此可知，胚胎后期（20～30 d）是力克斯兔的皮膚和其衍生物形成的重要時(shí)期，此時(shí)力克斯兔的皮膚處于不同結(jié)構(gòu)的分化階段。表皮細(xì)胞由單層細(xì)胞變?yōu)槎鄬蛹?xì)胞并形成了完整的表皮結(jié)構(gòu)，同時(shí)真皮層也逐漸發(fā)育形成。力克斯兔的毛囊由皮膚生發(fā)層細(xì)胞強(qiáng)烈增殖而形成[12]并逐漸發(fā)育出現(xiàn)成初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊，出生后繼續(xù)發(fā)育直至發(fā)育完全。在皮膚和其衍生物的發(fā)育過程中，表皮先于其他組織發(fā)育，為胚胎期力克斯兔的其他組織器官的發(fā)育提供一個(gè)與外界隔離正常的良好環(huán)境。出生后的皮膚結(jié)構(gòu)已基本發(fā)育完全，但真皮內(nèi)的毛囊會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，90 d時(shí)毛囊發(fā)育處于穩(wěn)定狀態(tài)。所以在力克斯兔的養(yǎng)殖過程中，家兔妊娠后期及仔兔出生后1個(gè)月內(nèi)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保證良好的營(yíng)養(yǎng)水平，這一階段對(duì)商品力克斯兔皮張的質(zhì)量起著關(guān)鍵性的作用。

[1]Pei Y L，Wu Y J，Cao J.Effects of chronic heat stress on the reproductive capacity of male Rex rabbits[J].Livestock Science，2012，146:13-21.

[2]李夢(mèng)云，位蘭.八點(diǎn)黑獺兔兔胃空腸肝組織結(jié)構(gòu)的試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47（5）:33-35.

[3]Parry A，Norton B，Kestall B J.Skin folliele development in the Australian goat[J].Agri Res，1992，43（4）:857-870.

[4]林吉茂，成醒民，羅時(shí)雙，等.關(guān)中奶山羊胎兒皮膚發(fā)育的組織形態(tài)觀察[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36（5）:43-48.

[5]王博，王春生，安鐵洙.小鼠皮膚及其毛囊早期發(fā)育的組織學(xué)觀察[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，15（6）:414-415.

[6]趙輝玲，林大光，孔佩蘭.力克斯兔被毛生物學(xué)特性研究[J]．中國(guó)養(yǎng)兔雜志，2001（2）:14-20．

[7]劉立群，霍金富，孔佩蘭.德系安哥拉兔皮膚和毛囊發(fā)生發(fā)育的研究[J].毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)，1990，1:3-6.

[8]周勤飛，陶可，王永才，等.母兔妊娠期飼糧蛋氨酸水平對(duì)仔兔毛囊發(fā)育的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24（2）:358-363.

[9]尹俊.內(nèi)蒙古絨山羊毛囊發(fā)育、生長(zhǎng)周期及相關(guān)基因的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2000.

[10]Hynd P I，Ponzoni R W，Grimson R，et al.Wool follicle and skin characters-their potential to improve wool citation[J].Wool Technology and Sheep Breeding，1996，44（3）:167-177．

[11]Stenn K S，Cotsarelis G.Bioengineering the hair follicle:fringe benefits of stem celltechnology[J].Current Opinion in Biotechnology，2005，16:1-5．

[12]吳添文.家兔毛囊發(fā)育規(guī)律及其相關(guān)基因的遺傳效應(yīng)、表達(dá)規(guī)律研究[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué)，2011.