周榮金，陳永珍,2，黎起秦，袁高慶，林緯

1 廣西大學農(nóng)學院，南寧 530005；

2廣東中能酒精有限公司，湛江 524018

植物保護

煙草灰霉病復合生防細菌的篩選

周榮金1，陳永珍1,2，黎起秦1，袁高慶1，林緯1

1 廣西大學農(nóng)學院，南寧 530005；

2廣東中能酒精有限公司，湛江 524018

采用平板對峙法和孢子萌發(fā)法，測定470株煙草內(nèi)生細菌對煙草灰霉病菌的抑菌活性，初篩出抑菌作用較強的27株菌株；利用煙葉組織法進行復篩，獲得防治效果超過50%的12株菌株，屬于芽孢桿菌屬或假單胞菌屬；測試了7株生防菌之間的親和性，除菌株Y98外，其他菌株之間均表現(xiàn)親和；根據(jù)菌株親和性及生防效果，選擇5株生防菌株進行混配，測定其對煙草灰霉病的防治效果，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌菌株Y11與假單胞菌菌株Y141在其比例為2:1時的防效較好，且高于單菌株處理。

煙草灰霉?。粡秃仙谰?；篩選

由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的煙草灰霉病在我國黑龍江、云南、貴州以及陜西煙區(qū)已有報道[1]。近年來在湖南、廣西及福建煙區(qū)具有加重危害的趨勢[2-4]。病原菌主要危害煙草葉片及莖部，在煙草整個生育期都可以發(fā)生，但以漂浮苗受害最重，一旦發(fā)生，易造成煙苗成叢死亡。條件合適時，大田期間繼續(xù)危害。因此，積極尋找安全有效防治煙草灰霉病的措施具有重要的實踐意義。

近年來，人們通過大量試驗發(fā)現(xiàn)，一些有益微生物以及抑菌植物對灰霉病菌有較強的抑制作用，并在一定情況下表現(xiàn)出較好的防治效果。生物防治日益成為控制灰霉病一條很有發(fā)展前景的途徑。但是，目前有關(guān)生防菌防治植物病害的研究多是針對某個單一菌株進行，在實際生產(chǎn)應(yīng)用時綜合防治效果常有變化，或偏低或不夠穩(wěn)定。一些研究表明，復合生防菌在環(huán)境適應(yīng)性、抗病范圍、防效穩(wěn)定性等方面比單一菌株更有優(yōu)勢，應(yīng)用復合生防菌能夠提高生防菌對植物病害的防治效果[5-6]。本研究對前期已得到的一批煙草內(nèi)生細菌[7]進行多重篩選，以期獲得具有生防開發(fā)潛力的有益菌株，在明確生防菌間的親和性的基礎(chǔ)上，構(gòu)建具有增效作用的生防菌組合，為開發(fā)有效防治煙草灰霉病的復合生防菌菌劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨（Nutrient Agar，NA）培養(yǎng)基的配制參照方中達[8]的方法。

菌株：470株煙草內(nèi)生細菌及煙草灰霉病菌均由廣西大學農(nóng)學院植物病理學研究室提供。內(nèi)生細菌使用前在NA培養(yǎng)基平板上于28℃培養(yǎng)1d，在NA培養(yǎng)液中于28℃120r/m培養(yǎng)48h；煙草灰霉病菌接種到PDA培養(yǎng)基平板上，于16℃恒溫條件下培養(yǎng)4d后，一部分制成7mm的菌餅備用，另一部分加入滅菌的蒸餾水洗脫，制成孢子懸浮液備用。

煙草品種及基質(zhì)：煙草品種為云煙97，由廣西壯族自治區(qū)煙草公司提供；全價育苗基質(zhì)（有機質(zhì)+腐殖酸≥50%）由長春市賽世農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責任公司生產(chǎn)。

農(nóng)藥：對照藥劑25%異菌脲懸浮劑由江蘇省徐州潤澤化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌初篩

采用平板對峙培養(yǎng)法和孢子萌發(fā)法初步篩選拮抗菌。平板對峙培養(yǎng)法：將內(nèi)生細菌在PDA培養(yǎng)基平板的中間劃一直線，距離劃線兩側(cè)20mm處接煙草灰霉病菌菌餅，每處理重復4次，于23℃恒溫培養(yǎng)3d后測量培養(yǎng)基平板上的抑菌帶寬度。孢子萌發(fā)法：將波長600nm下OD值為0.35的細菌菌液與光學顯微鏡100倍鏡下有40～50個灰葡萄孢孢子懸浮液等比例混合，并加入0.1%葡萄糖液以促進孢子萌發(fā)。置于25℃恒溫保濕培養(yǎng)12h，在光學顯微鏡下隨機觀察不同視野下病菌孢子（共200個）的萌發(fā)情況，統(tǒng)計其孢子萌發(fā)率，按下式計算抑制率。以含有相對濃度的培養(yǎng)液和葡萄糖液混合液作為對照。每處理重復3次。

1.2.2 拮抗菌復篩

采用煙葉組織法對初篩結(jié)果進行復篩：采集健康煙草葉片，每張煙草葉片一邊噴施煙草內(nèi)生菌液的5倍稀釋液（含0.1%吐溫），另一邊噴施等量的培養(yǎng)液（含0.1%吐溫）作為空白對照，之后接種煙草灰霉病菌菌餅，每處理3張葉片，每張葉片接6塊菌餅，20℃恒溫保濕培養(yǎng)6d后測量病斑直徑，按下式計算防治效果。以225 mg/L的異菌脲作為藥劑對照。

1.2.3 生防菌株之間的親和性測試

根據(jù)前期離體抑菌活性與煙葉組織法測定結(jié)果，選擇目標生防菌株，采用打孔法進行親和性測定。具體為：在NA培養(yǎng)基平板上均勻的打4個孔洞（直徑為7mm），取其中1株目標生防菌株菌液（OD600=1.0）50 μL加入到其中一個孔洞作為挑戰(zhàn)菌株，將其他目標生防菌株作為被挑戰(zhàn)菌株，分別取其50 μL菌體懸浮液（OD600=1.0）加入到其他的孔洞中，置于28℃恒溫培養(yǎng)2d后，觀察親和性反應(yīng)試驗結(jié)果。不產(chǎn)生抑菌圈者計為親和，產(chǎn)生抑菌圈者計為不親和。依次將所有目標生防菌株分別作為挑戰(zhàn)菌株和被挑戰(zhàn)菌株進行上述親和性測試，每處理重復3次。

1.2.4 生防菌單菌株與復合菌株防治效果比較

根據(jù)親和性測試結(jié)果，選取有代表性的相互親和的目標生防菌株，首先按照等量混配比例混配，比較單菌株與復合菌株的防治效果。根據(jù)結(jié)果選擇防效較好的菌株組合按照不同比例進行混配，比較其防治效果。試驗方法參照1.2.2。

1.2.5 復合菌株對煙草灰霉病的盆栽防治效果

供試煙草品種為云煙97，有機質(zhì)育苗45d（4、5葉期），置于溫室中（22±5℃）。試驗共設(shè)5個處理：振蕩培養(yǎng)48h的生防菌Y11與Y141按照 2:1比例配置復合生防菌液，Y11菌液，Y141菌液，300mg/L異菌脲作為藥劑對照，無菌水為空白對照。其中生防菌液稀釋5倍，每株煙草莖基部灌入50mL菌液。每處理15株，3次重復。菌液或藥劑處理48h后，在煙草莖基部接種直徑7mm的煙草灰霉病菌菌餅，45d后計算死株率和防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌初篩

平板對峙法顯示，470株煙草內(nèi)生細菌中有70株對煙草灰霉病菌的抑菌帶寬度大于1.50mm，其中，27株菌株的抑菌帶寬度大于5.0 mm，超過7.8 mm的菌株有10株，它們之間的差異未達到顯著水平。另有32株菌株雖然沒有出現(xiàn)抑菌帶，但是可在培養(yǎng)基上快速蔓延生長，并能完全抑制煙草灰霉病菌菌落的擴展，從而表現(xiàn)出營養(yǎng)競爭作用。孢子萌發(fā)法中，有72株菌株的孢子萌發(fā)抑制率大于50%。其中，有26株生防菌的抑制率超過95%，達到100%的生防菌有13株（見表1和圖1）。結(jié)合平板對峙法和孢子萌發(fā)法結(jié)果，從中挑選出拮抗作用較強的27株細菌作下一步試驗，根據(jù)陳永珍等對這些煙草內(nèi)生細菌的初步分類[7]，其中G1和G110屬于腸桿菌屬(Enterobacter)；G2和J52屬于土壤桿菌屬(Agrobacterium)；G130、J37、J50、J130、Y29、Y39、Y54、Y58、Y68、Y82、Y86、Y88、Y98、Y113、Y141等 15株 屬 于假單胞菌屬 (Pseudomonas)；J29、J30、J80、Y11、Y19、Y38、G59、G81等8株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表1 部分內(nèi)生細菌菌株對煙草灰霉病菌的抑菌作用Tab. Inhibition effect of some endophytic bacteria strains on Botrytis cinerea

圖1 生防菌的離體平板對峙法篩選(a：無拮抗作用和營養(yǎng)競爭作用；b：拮抗作用；c：營養(yǎng)競爭作用)Fig.1 Screening of biocontrol bacteria by flat-stand method (a:no antagonistic effect or nutrition competitive effect; b: antagonistic effect; c: nutrition competitive effect )

2.2 拮抗菌復篩

表2顯示，離體平板表現(xiàn)出抑制作用的27株菌株對煙葉上煙草灰霉病病斑的擴展表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。防治效果在50%以上有12株，占44.44%，為芽孢桿菌或假單胞菌；防治效果在60%以上有5株，占18.52%，其中 2株為芽孢桿菌，3株為假單胞菌。

表2 27株拮抗菌株對煙草灰霉病的防治效果Tab.2 Control efficiency of 27 antagonistic strains on tobacco grey mould

2.3 目標生防菌之間的親和性

選取3株芽孢桿菌（Y11、G59和G81）以及4株假單胞菌屬（Y98、Y141、Y88和Y29）進行親和性反應(yīng)測試。當菌株Y98作為挑戰(zhàn)菌株時，與其余所有的菌株均表現(xiàn)親和性，而Y98作為被挑戰(zhàn)菌株時，僅與Y29和Y141表現(xiàn)親和性，與G59、G81、Y11和Y88表現(xiàn)為拮抗；其余菌株不管作為挑戰(zhàn)菌株還是被挑戰(zhàn)菌株，各菌株間均表現(xiàn)為親和。

2.4 生防菌株組合的篩選結(jié)果

根據(jù)2.3的試驗結(jié)果并結(jié)合這7株生防菌對煙草灰霉病的抑制作用以及它們的初步分類結(jié)果，對3株芽孢桿菌（Y11、G59和G81）和2株假單胞菌（Y141和Y88）進行混配。由表3可看出，Y11+Y88+Y141+G59菌株組合的防治效果顯著低于其他處理，僅為42.41%；其次為Y11+Y141+G59菌株組合，防治效果為54.01%，這兩組菌株組合的防治效果均低于任何一株單菌株的防治效果。Y11+Y141菌株組合處理的病斑直徑為17.8mm，防治效果達到72.02%，比任何單菌株和菌株組合的防治效果高，但與Y11 和G59單菌株處理以及Y11和G59混配處理相比未達到顯著水平，而其余菌株組合的防治效果與單菌株的防治效果比較接近或者更低。

表3 單菌株和復合菌株對煙草灰霉病的防治效果Tab.3 Control efficiency of single and complex strains on tobacco grey mould

2.5 復合生防菌株不同混配比例的確定

根據(jù)2.4的試驗結(jié)果，由于Y11和Y141菌株組合中含有芽孢桿菌和假單胞菌這2種不同的生防菌，選擇該菌株組合測定其不同混配比例對煙草灰霉病的防治效果。表4和圖2顯示，Y11與Y141組合中比例為2:1的防治效果達到75.68%，高于其他任何混配比例和單菌株處理的防治效果，但與同等比例混配的處理結(jié)果沒有顯著差異。

2.6 復合生防菌株對煙草灰霉病的盆栽防治效果

復合生防菌對煙草灰霉病的盆栽防治作用如表5和圖3所示。藥劑對照異菌脲處理的防治效果最好，極顯著高于生防菌液處理；Y11與Y141按照2:1混配的防治效果為65.81%，高于單一菌株Y11或Y141處理，但與Y11處理相比，尚未達到顯著水平。

表4 復合生防菌株不同混配比例對煙草灰霉病的防治效果Tab.4 Control efficiency of complex biocontrol strains in different ratios on tobacco grey mould

圖2 煙葉組織法測定拮抗菌單菌株和復合菌株對煙草灰霉病的防治效果Fig.2 Control efficiency of single and complex antagonistic strains on tobacco grey mould by tobacco leaves tissues method

表5 復合生防菌株對煙草灰霉病的盆栽防治效果Tab.5 Control efficiency of complex biocontrol strains on grey mould of potted tobacco

圖3 拮抗菌復合菌株對煙草灰霉病的盆栽防治效果（接種10 d）Fig.3 Control efficiency of complex antagonistic strains on grey mould of potted tobacco (inoculation 10 d)

3 討論

平板對峙法和孢子萌發(fā)法結(jié)果中，許多菌株在抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)上有很大不同，如菌株Y62和Y141，對病原菌菌絲生長的抑制能力明顯大于菌株J37和Y88，而對病菌孢子萌發(fā)的抑制作用卻遠小于菌株J37和Y88；另外，27株生防菌株的活體復篩結(jié)果顯示，生防菌抑制煙草灰霉病病斑擴展的能力與離體平板抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)的結(jié)果不完全一致。其原因可能和菌株產(chǎn)生具有拮抗作用的代謝物質(zhì)有關(guān)。拮抗物質(zhì)作為生防菌的防病的機制之一，不同種類的拮抗菌或同種拮抗菌的不同株系產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)都有可能不同[9-11]，還有些生防菌可能誘導植株產(chǎn)生抗病性。誘導抗病性的產(chǎn)生使得某些生防菌株在培養(yǎng)基平板上抑菌能力弱而活體防治效果好，因此生防效果不一定完全依賴于拮抗物質(zhì)[12-13]。鑒于生防菌株常常存在多種防病機制，在進行植物病害生防菌的篩選時，單純依靠一種方法來篩選某一種植物病害的生防菌是不夠全面的。采用多種篩選方法相結(jié)合，有利于篩選出不同抗病機制的生防菌[14]，從而獲得較強的、較穩(wěn)定的拮抗菌株。目前在植物病害生物防治中，已經(jīng)獲得很多種具有不同抗病機制的優(yōu)良生防菌株，將這些生防菌株進行不同的混配組合，從構(gòu)建復合菌株的角度來看，探索這些具有不同防病機制的生防菌株的復合，將顯著提高生防菌的防治效果，拓寬生防菌的應(yīng)用范圍，為生防菌及其制劑的發(fā)展提供了新思路。

本文前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤桿菌屬和腸桿菌屬為煙草內(nèi)生細菌中的優(yōu)勢種群，但本研究綜合多種方法篩選出的具有應(yīng)用潛力的煙草內(nèi)生細菌均為芽孢桿菌或假單胞菌，這種植株內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群和生防菌優(yōu)勢種群的不一致可能會影響到生防菌對病害的防治效果，此領(lǐng)域尚需深入探討。

4 結(jié)語

在470株煙草內(nèi)生細菌中，有2株芽孢桿菌和3株假單胞菌對煙草灰霉病菌的離體和活體抑菌活性均較強；將芽孢桿菌菌株Y11和假單胞菌菌株Y141按照2：1體積比混配，對煙草灰霉病的防治效果較好，且高于單菌株處理，說明在防治煙草灰霉病方面，Y11和Y141復合生防菌有較大的開發(fā)潛力，但對其具體分類地位、作用機理和應(yīng)用方法等仍需要進一步研究。

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Screening of bacteria strain complex against tobacco grey mould

ZHOU Rongjin1,CHEN Yongzhen1,2,LI Qiqin1,YUAN Gaoqing1,LIN Wei1
1 College of Agriculture,Guangxi University,Nanning 530005,China;
2 Guangdong Zhongneng Alcohol CO.LTD,Zhanjiang 524018,China

Antibacterial activities of 470 endophytic bacteria strains in tobacco againstBotrytis cinereawere determined by flat-stand and spore germination methods.27 strains with strong inhibition effects were selected.Another 12 strains with control efficiency over 50%were further screened with tobacco leaf tissue method,and these strains were classified asBacillusorPseudomonas.Results of compatible reactions of 7 strains showed that most of strains displayed compatibility except Y98.According to compatible reactions and biocontrol efficiency results,5 strains were mixed together to study control effect on tobacco grey mould.It was shown that the control efficiency of mixedBacillusstrainY11 andPseudomonasstrain Y141in the ratio of 2:1 was higher than that of single strain treatment.

tobacco grey mould; biocontrol bacteria complex; screening

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.06.017

S476 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）06-0107-06

廣西大學科研基金項目（XBZ120839）

周榮金（1986—），碩士研究生，主要研究方向為植物細菌性病害及其防治，Email：1120325529@qq.com

袁高慶（1971—），博士，副教授，主要研究方向為植物土傳病害及其生物防治，Email：ygqtdc@sina.com

2013-12-01