張漢松，馮照軍，程 超

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州 221116)

赤擬谷盜Tribolium castaneum (Herbst)和雜擬谷盜Tribolium confusum (Jac du Val)均隸屬于鞘翅目Coleoptera、擬步行蟲(chóng)科Tenebrionidae、擬谷盜屬Tribolium，是兩種重要的世界性儲(chǔ)糧害蟲(chóng)，其成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)除直接為害面粉、麩皮、米糠、禾谷類(lèi)籽實(shí)等外，成蟲(chóng)體表的臭腺還可分泌含苯醌等致癌物質(zhì)的臭液，使被害物結(jié)塊、變色、發(fā)臭而不能食用(Campbell et al.，2004)。目前，化學(xué)殺蟲(chóng)劑是防治赤擬谷盜和雜擬谷盜的重要手段，研究表明赤擬谷盜和雜擬谷盜在未成熟期(卵、幼蟲(chóng)和蛹)比其在成熟期(成蟲(chóng))對(duì)殺蟲(chóng)劑敏感，且赤擬谷盜比雜擬谷盜對(duì)殺蟲(chóng)劑敏感(Authur and Hoernemann，2004;Authur et al.，2009)。為提高化學(xué)防治效果并減少殺蟲(chóng)劑的使用，對(duì)儲(chǔ)糧工作者來(lái)說(shuō)應(yīng)在赤擬谷盜和雜擬谷盜的未成熟期進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，但是赤擬谷盜和雜擬谷盜為近緣種甲蟲(chóng)，其卵、幼蟲(chóng)和蛹外部形態(tài)和大小相同、不能區(qū)分，其成蟲(chóng)外部形態(tài)和大小相似、很難區(qū)分(沈兆鵬，1998)。另外，在我國(guó)檢疫口岸，赤擬谷盜與雜擬谷盜也是一類(lèi)常有截獲的甲蟲(chóng)，它們大多處于幼蟲(chóng)和蛹階段，需要等其羽化為成蟲(chóng)后才能進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，但是檢疫的工作性質(zhì)要求快檢快放，這為檢疫工作帶來(lái)了不便(張生芳和周玉香，2002)。因此，對(duì)儲(chǔ)糧工作者和口岸檢疫人員來(lái)說(shuō)，有必要建立一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的分子方法來(lái)鑒別赤擬谷盜與雜擬谷盜。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，用于物種分子鑒定的方法較多，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RFLP)、微衛(wèi)星 DNA(Microsatellite DNA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)等，其中PCR-RFLP 是PCR 擴(kuò)增與傳統(tǒng)RFLP 技術(shù)的結(jié)合，是一種較為容易和可靠的方法(Arimoto et al.，2013)。真核生物細(xì)胞核基因組中28S 核糖體RNA (28S ribosomal RNA，28S rRNA)基因高度保守、易于進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，同時(shí)28S rRNA 基因來(lái)源于核DNA，避免了線粒體DNA 由于母性遺傳對(duì)分支分析造成的影響，常用于進(jìn)行屬內(nèi)不同種之間的遺傳分化、系統(tǒng)發(fā)育分析和分子鑒定(Cepeda et al.，2012)。本研究擬對(duì)赤擬谷盜和雜擬谷盜的28S rRNA 基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、序列測(cè)定和分析，試圖找到其種特異性限制性內(nèi)切酶并建立對(duì)它們進(jìn)行種間分子鑒定的PCR-RFLP 分析方法，以期為倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)管理和口岸檢疫工作提供技術(shù)幫助和支持。

1 材料與方法

1.1 供試甲蟲(chóng)

赤擬谷盜與雜擬谷盜成蟲(chóng)采自江蘇省徐州市銅山區(qū)三堡面粉廠，帶回實(shí)驗(yàn)室在體視顯微鏡下按其形態(tài)學(xué)特征 (Bousquet，1990;沈兆鵬，1998)進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定，并根據(jù)其生殖器和第一對(duì)足上有無(wú)性斑 (Hinton，1942;Faustini et al.，1981)進(jìn)行雌雄鑒別。

1.2 DNA 提取

將單個(gè)試蟲(chóng)在研缽中充分研磨，用異硫氰酸胍法(Ming and Wang，2006)提取其基因組DNA，室溫晾干后懸浮于20μL 滅菌的雙蒸水中，-20℃保存。

1.3 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

28S rRNA 基因的擴(kuò)增引物為:D2-3665F (5'-AGAGAGAGTTCAAGAGTACGTG-3')和D5-4749R (5'-GTTACACACTCCTTAGCGGA-3')(Angelini and Jockusch，2008)。PCR 反應(yīng)在TaKaRa 擴(kuò)增儀上進(jìn)行:94℃預(yù)變性5 min;94℃50 s，55℃45 s，72℃60 s，33個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min 。PCR 反應(yīng)總體積是34μL，其中包括2× PCR Reaction Mix (TIANGEN)17μL，Taq DNA 聚合酶0.3μL，DNA 模板1.3μL，上游/下游引物(10 mol/L)各1.4μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物2μL 在0.75%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，然后送至上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。擴(kuò)增引物和測(cè)序引物均由上海捷瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。分別對(duì)赤擬谷盜與雜擬谷盜各15 頭的基因組DNA 進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析。

1.4 序列變異和限制性酶切位點(diǎn)分析

使用Clustal X (version 2.0)軟件(Larkin et al.，2007)進(jìn)行序列比對(duì)，相同的序列歸為一個(gè)單倍型?；趩伪缎托蛄?，用MEGA 5.05 軟件(Tamura et al.，2011)統(tǒng)計(jì)分析其種內(nèi)和種間遺傳變異和核苷酸替換;用BioXM 2.6 軟件(http://www.bio-soft.net/format/bioxm.htm)分析其限制性酶切位點(diǎn)，找出種特異性的限制性內(nèi)切酶。

1.5 PCR 產(chǎn)物的酶切

使用種特異性限制性內(nèi)切酶PvuI (Fermentas，USA)對(duì)28S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)過(guò)程參照PvuI 使用說(shuō)明書(shū)。酶切反應(yīng)總體積為30μL，包括PCR 產(chǎn)物10μL、10× Buffer R 2μL、限制性內(nèi)切酶PvuI 2μL、滅菌雙蒸水16μL，37℃溫育2 h，0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切片段。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

赤擬谷盜與雜擬谷盜的樣品DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，均擴(kuò)增出一個(gè)約1070 bp的DNA 片段，擴(kuò)增結(jié)果不受蟲(chóng)種和性別的影響(圖1)。

圖1 赤擬谷盜與雜擬谷盜28S rRNA 基因片段的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of Tribolium castaneum and Tribolium confusum 28S rRNA gene segments

2.2 序列分析

在測(cè)序的赤擬谷盜與雜擬谷盜30個(gè)個(gè)體的28S rRNA 基因序列中存在2個(gè)單倍型，種內(nèi)各有1個(gè)單倍型，種間沒(méi)有相同的單倍型。2個(gè)單倍型序列已提交 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為:JX412253，JX412254。

赤擬谷盜與雜擬谷盜28S rRNA 基因序列比對(duì)后用于分析的長(zhǎng)度為1072 bp，有4個(gè)插入或缺失發(fā)生。如圖2 所示，在28S rRNA 基因區(qū)的1072個(gè)核苷酸位點(diǎn)中，赤擬谷盜與雜擬谷盜種內(nèi)均沒(méi)有變異位點(diǎn)，而種間的變異位點(diǎn)數(shù)為76個(gè)，其中轉(zhuǎn)換A?G 和C?T的發(fā)生次數(shù)分別為30 和26，顛換A?C、A?T、C?G 和G?T的發(fā)生次數(shù)分別為5、11、1 和3，轉(zhuǎn)換發(fā)生次數(shù)(ti=56)約是顛換發(fā)生次數(shù)(tv=20)的3 倍，28S rRNA 基因區(qū)表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換/顛換比(ti/tv=2.80)。

圖2 赤擬谷盜(CS)與雜擬谷盜(CF)28S rRNA 基因片段的序列變異位點(diǎn)Fig.2 Variable sites of the 28S rRNA gene segments in Tribolium castaneum (CS)and Tribolium confusum (CF)

2.3 酶切位點(diǎn)分析

9 種限制性內(nèi)切酶對(duì)赤擬谷盜和雜擬谷盜28S rRNA 基因序列的酶切位點(diǎn)和產(chǎn)生的酶切片段不同(表1)。在這9 種限制性內(nèi)切酶里，PvuI 在兩個(gè)種的序列上都有酶切位點(diǎn)，可產(chǎn)生明顯的酶切片段差異(赤擬谷盜2個(gè)酶切片段，雜擬谷盜3個(gè)，且片段大小不同);BstBI 在兩個(gè)種的序列上也都有酶切位點(diǎn)，但產(chǎn)生的酶切片段差異不大(赤擬谷盜2個(gè)酶切片段，雜擬谷盜也是2個(gè)，且片段大小接近);其它7 種限制性內(nèi)切酶僅在一個(gè)種的序列上存在酶切位點(diǎn)。

2.4 酶切結(jié)果

PvuI 對(duì)赤擬谷盜和雜擬谷盜28S rRNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物均能進(jìn)行酶切，產(chǎn)生的種特異性酶切圖譜(酶切條帶數(shù)和條帶大小) (圖3)與酶切位點(diǎn)分析(表1)完全一致。

表1 赤擬谷盜與雜擬谷盜28S rRNA 基因的限制性酶切片段長(zhǎng)度分析Table1 Fragment length for restriction digests of Tribolium castaneum and Tribolium confusum 28S rRNA gene segments

圖3 赤擬谷盜與雜擬谷盜28S rRNA 基因片段的限制性內(nèi)切酶PvuI 酶切Fig.3 Restriction enzyme PvuI digests of Tribolium castaneum and Tribolium confusum 28S rRNA gene segments

3 結(jié)論與討論

本研究使用通用引物很容易從單個(gè)試蟲(chóng)提取的微量基因組DNA 中對(duì)28S rRNA 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)表明該目的基因條帶明亮且沒(méi)有非特異性擴(kuò)增(圖1)，這可能是因?yàn)?8S rRNA 基因在核基因組里是高拷貝基因。Nowaczyk 等(2009)利用兩個(gè)種特異性引物分別PCR 擴(kuò)增赤擬谷盜與雜擬谷盜核糖體DNA (rDNA)的ITS 區(qū)，但是rDNA的ITS 區(qū)高度可變，不易進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，不能擴(kuò)增可能是由于技術(shù)原因或樣本DNA 質(zhì)量，而不是因?yàn)槿狈ΨN特異性序列，從而導(dǎo)致假陰性出現(xiàn)。本研究中28S rRNA 基因區(qū)的PCR-RFLP 分析可避免這種假陰性的出現(xiàn)，原因是使用的是通用引物，容易進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，基本不會(huì)出現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增條帶，排除了因技術(shù)原因、樣本DNA 質(zhì)量和引物問(wèn)題而導(dǎo)致的無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。

在28S rRNA 基因區(qū)的1072個(gè)核苷酸位點(diǎn)中，赤擬谷盜與雜擬谷盜種內(nèi)均沒(méi)有核苷酸變異位點(diǎn)，而種間的變異位點(diǎn)數(shù)為76個(gè)，說(shuō)明該基因區(qū)核苷酸序列種間有很多變異，而種內(nèi)沒(méi)有變異、非常保守。經(jīng)Blast 比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，本研究中所用赤擬谷盜與雜擬谷盜種群的28S rRNA 基因序列與Angelini 和Jockusch (2008)所用種群的該序列相似性分別為99%和100%，這進(jìn)一步說(shuō)明所擴(kuò)增的赤擬谷盜與雜擬谷盜28S rRNA 基因區(qū)在種內(nèi)均是非常保守的。由于赤擬谷盜與雜擬谷盜28S rRNA基因區(qū)序列的種內(nèi)保守性和種間多態(tài)性，該基因區(qū)適于進(jìn)行其種內(nèi)和種間的酶切圖譜分析。

在赤擬谷盜與雜擬谷盜28S rRNA 基因區(qū)，9種限制性內(nèi)切酶顯示能產(chǎn)生種特異性的酶切位點(diǎn)和酶切片段(表1)。在這9 種限制性內(nèi)切酶里，BfrBI，BspEI，EagI，NdeI，NsiI，Ppu10I 和SalI 在一個(gè)種的28S rRNA 基因區(qū)存在酶切位點(diǎn)而在另一個(gè)種不存在酶切位點(diǎn)，它們不能被用來(lái)區(qū)分赤擬谷盜和雜擬谷盜，原因是不能酶切可能是技術(shù)原因或沒(méi)有酶切位點(diǎn)的緣故，這樣就有可能出現(xiàn)假陰性。本研究中假陰性可以避免，原因是選用的PvuI 在赤擬谷盜和雜擬谷盜都有酶切位點(diǎn)，但其酶切位點(diǎn)的位置和數(shù)目不同，可產(chǎn)生種特異性的酶切圖譜(圖3)。

由于赤擬谷盜與雜擬谷盜在未成熟期不能進(jìn)行鑒別，本研究以在面粉廠采集的赤擬谷盜與雜擬谷盜成蟲(chóng)作為試蟲(chóng)，鑒于其在成熟期(成蟲(chóng))和未成熟期(幼蟲(chóng)和蛹)的基因組DNA 不變，因此建立的PCR-RFLP 方法也同樣適用于赤擬谷盜和雜擬谷盜幼蟲(chóng)或蛹的分子鑒定。分別提取赤擬谷盜和雜擬谷盜幼蟲(chóng)或蛹的基因組DNA，對(duì)28S rRNA 基因進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增和測(cè)序分析，結(jié)果表明幼蟲(chóng)或蛹的28S rRNA 基因序列與其成蟲(chóng)完全一致。

綜上所述，赤擬谷盜和雜擬谷盜28S rRNA 基因容易進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，存在著種特異性的酶切圖譜，建立的PCR-RFLP 分析方法可用于赤擬谷盜與雜擬谷盜的分子鑒定。

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