向延芳，傅玉才，許錦階，栗麗，羅麗莉＊

（1.解放軍第169醫(yī)院婦產科，衡陽 421002；2.汕頭大學醫(yī)學院細胞衰老實驗室，汕頭 515041；3.汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦科，汕頭 515041）

始基卵泡自胚胎形成后即進入自主發(fā)育和閉鎖的軌道，當功能性卵泡完全喪失后，卵巢衰老萎縮進入絕經期［1］。卵泡從卵巢中持續(xù)丟失，就好像時鐘的指針在不斷前進，所以國外有學者將這一現(xiàn)象稱為“女性的生物鐘”［2］。始基卵泡的儲備量與生俱來，如果能延緩卵泡成熟的速度，減少卵泡的凋亡將可能延長女性的生育年限［3］。能量限制（CR）是一種目前公認的有效延緩衰老的方法，不僅能延緩衰老，還能延緩和預防一些與年齡相關疾病的發(fā)生發(fā)展［4－5］。本實驗中對成年期大鼠限制其能量攝入，觀察CR后長壽因子SIRT1在卵巢中的定位、表達，探討其對大鼠卵巢功能和生殖壽命的影響及可能機制，為抗卵巢衰老研究提供新的實驗依據。

材料與方法

一、實驗動物及分組

由汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心提供清潔級健康8周齡雌性Sprague－Dawley（SD）大鼠24只，初始體重（200±10）g。實驗期間，動物房室溫保持在22℃左右，保持12h自動照明。

動物適應性喂養(yǎng)2周后隨機分為：對照組（NC），自由飲水，自由取食；CR組，予NC組食量的65%。標準鼠糧持續(xù)喂養(yǎng)8周，飼料（執(zhí)行標準：GB14924.3－2001，含蛋白質20.11%、脂肪4.84%、粗纖維7.34%）總能量為17.3282MJ／kg。

二、儀器和試劑

儀器：BX－51TRF型生物顯微鏡（Olympus，日本），普通光學顯微鏡（云南光學儀器廠），動物飼養(yǎng)層流柜（廣州醫(yī)療器械廠）。

試劑：蘇木精（上?；瘜W試劑采購供應站試劑廠），伊紅（上海試劑三廠），戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司），兔抗鼠SIRT1、β－actin多克隆抗體（Santa Cruz，美國），生物素連接的抗兔IgG抗體（Jackson，美國）；ABC（avidin－biotin complex）試劑盒（Vector Laboratories，美國）。

三、研究方法

1.卵巢組織形態(tài)學觀察及卵泡分類計數：每個卵巢取7張組織切片，切片間隔至少為50μm進行H－E染色。計數每張卵巢組織切片上所有的各級卵泡數（原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡）。

2.免疫組織化學法（ABC法）檢測SIRT1在卵巢組織中的定位和表達：組織切片脫蠟、水化后，3%H2O2作用10min，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次時間為5min。2%的小牛血清白蛋白封閉30min后滴加兔抗鼠SIRT1抗體（一抗），4℃濕盒中孵育過夜；PBS緩沖液洗滌后滴加二抗，室溫孵育1h；與ABC試劑反應30min；DAB顯色后蘇木素復染、1%鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片。PBS替代一抗作為空白對照。Olympus BX－51型顯微鏡（日本）下觀察并拍照。陽性結果判斷：細胞內棕色或棕黃色顆粒為陽性結果。應用SimplePCI軟件進行分析計數，灰度值≤55為強陽性，反之為弱陽性。

3.Western blot檢測SIRT1蛋白在卵巢中的表達：取新鮮的卵巢放入組織勻漿器中，冰上勻漿提取組織總蛋白，測蛋白濃度；各實驗組均上樣30μg蛋白，進行SDS－PAGE電泳，轉膜；5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，分別加入稀釋的β－actin或SIRT1抗體約1ml于室溫下?lián)u床孵育2h；棄一抗，洗滌后加二抗室溫下?lián)u床孵育1h，加入ABC反應試劑，ECL化學發(fā)光，暗室下X光片成像。GIS凝膠成像系統(tǒng)（上海 Tanon GIS－2009）分析其灰度值。

四、觀察指標

能量攝入：每天稱取飼料，計算攝取熱量；大鼠體重：每周稱取體重記錄；腹部脂肪重量：實驗結束時分離腎周組織和腹膜后脂肪稱重；卵巢組織形態(tài)學及卵泡分類計數；STRT1蛋白在卵巢中的定位和表達。

五、統(tǒng)計學方法

結 果

一、兩組大鼠每周平均體重比較

圖1 兩組大鼠體重變化情況

與對照組大鼠比較，CR組的大鼠表現(xiàn)為體重不增或略降，10d左右逐步好轉。實驗開始后，NC組大鼠體重逐漸增加，實驗結束時體重為（235.24±2.88）g，與實驗開始時體重［（195.97±3.09）g］相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；CR組的體重也是從實驗開始的（200.41±3.02）g逐漸增加到實驗結束時的（220.77±2.34）g（P＜0.001）；實驗結束時，CR組的大鼠體重與NC組相比有顯著性差異（P＜0.05）（圖1）。

二、兩組大鼠腹部脂肪比較

實驗結束時，CR組大鼠的腹部脂肪量為（3.86±0.22）g，明顯少于 NC組大鼠［（5.51±0.18）g］（P＜0.01）。

三、兩組大鼠卵巢的卵泡數變化

CR組和 NC組的初級卵泡［（25.2±1.4）vs.（21.9±0.9）］、次級卵泡［（18.0±0.8）vs.（20.5±1.4）］和閉鎖卵泡數［（25.2±1.1）vs.（27.8±1.2）］均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；但是CR組與NC組相比，原始卵泡數顯著增多［（91.5±2.6）vs.（62.3±2.6）］，竇狀卵泡數顯著減少［（15.2±0.6）vs.（23.0±1.8）］（P＜0.01）。

四、免疫組織化學實驗結果

SIRT1在卵巢組織中的卵母細胞和間質組織中均有表達，棕色或棕黃色顆粒可見于細胞漿和細胞核中。NC組卵巢中卵母細胞核內表達，部分強陽性，胞漿弱陽性，周邊間質組織部分弱陽性；能量CR組中卵母細胞核強陽性表達，胞漿陽性表達，周邊間質組織陽性表達（如箭頭所指）（圖2）。

圖2 SIRT1蛋白在卵巢中的表達與定位（免疫組化ABC法，×200）

五、CR對大鼠卵巢組織中SIRT1蛋白表達的影響

Western blot檢測顯示，CR組大鼠卵巢組織中的SIRT1高表達，灰度值掃描值與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 免疫印跡法檢測卵巢中SIRT1的表達

討 論

1935年，McCay等［6］首次報道了CR能顯著提高大鼠的平均壽命和最長壽命，后續(xù)對酵母、蠕蟲、果蠅以及哺乳動物的實驗陸續(xù)證明，在滿足機體對各種營養(yǎng)素需要量的前提下，適當限制能量攝入，能明顯延緩衰老的速度。過去的幾十年中，美國威斯康星州國立靈長類動物研究中心（WNPRC）和國立衛(wèi)生院（NIH）動物研究中心一直對延長靈長類動物的壽命進行CR的相關研究［7－8］，根據其研究結果，30%左右的CR以及18%的體重下降對于壽命的延長及健康的改善最為有效，因此本研究選用35%作為能量限制作為研究標準。

CR可減少與年齡相關的疾病的發(fā)生率在靈長類、人類實驗中已有了初步的結果［9－11］。CR是唯一被科學界普遍公認的除遺傳操作以外延緩衰老的調控手段，可促進脂肪動員，預防脂類代謝紊亂造成的許多疾病，最終延長壽命。了解CR引起這些效應的作用機制有助于指導人類的飲食和生活方式，起到延緩衰老、預防疾病發(fā)生的作用。

本研究中NC組大鼠體重在整個實驗過程中持續(xù)增加，35%CR組大鼠在經歷1周左右的體重不增后緩慢增長。CR組大鼠無營養(yǎng)不良表現(xiàn)，與實驗開始時體重相比增加明顯，但實驗結束CR組的大鼠體重顯著低于NC組，CR組腹周脂肪量明顯小于NC組，說明減少過度的能量攝入使大鼠的體重減輕、體內脂肪量減少。同時CR組的原始卵泡數比NC組明顯增多，竇狀卵泡數減少，與Selesniemi等［12］的研究結果一致。由于卵巢的總卵泡數在胚胎時期就已經是確定的，不能再生［13］，原始卵泡的數目是女性的基本生殖單位也是卵巢儲備的唯一形式［14］。當原始卵泡向著不同級卵泡成熟轉化時，原始卵泡不斷減少并最終耗竭殆盡。我們的實驗結果表明CR可以阻止原始卵泡向成熟卵泡的轉化，減少原始卵泡的消耗，保留卵巢的儲備從而延長生殖壽命。

Sir2（silence information regulator 2）基因家族是一種保守的從古細菌到哺乳動物都存在的NAD＋（煙酰腺嘌呤二核苷酸）依賴的組蛋白／非組蛋白去乙?；?，對細胞的分化、代謝、衰老等生理活動都起著十分重要的調節(jié)作用［15］，是調節(jié)生物體衰老進程的一個重要基因，其不僅能從遺傳角度影響壽命，還能從CR的代謝角度調節(jié)細胞壽命，被認為是CR介導發(fā)揮效應的一個關鍵調節(jié)因子［16－17］。研究發(fā)現(xiàn)，CR能夠引起Sir2的表達上調，并且這一現(xiàn)象從低等生物酵母到高等生物如哺乳類動物、靈長類動物等都普遍存在［18］，哺乳動物共有7個Sir2同源基因（SIRT1～SIRT7），其中SIRT1與Sir2的同源性最高［19］。

由于人類壽命明顯延長和婚育年齡的推遲，探索如何延長生殖壽命，延緩生殖系統(tǒng)衰老顯得至關重要。我們實驗研究中CR大鼠卵巢的SIRT1表達增強，卵巢的儲備增加，提示SIRT1對于延緩卵巢衰老延長生殖壽命有積極的作用。在關于各種細胞功能的研究中，SIRT1對心臟［20］、胰腺［21］、腦血管［22］等均有保護作用，因此，SIRT1作為治療不同疾病的靶點越來越被重視。隨著研究的深入，它與疾病的相關性將給我們提供新的臨床思路，SIRT1有可能作為特定作用靶點具有治療潛能。

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