王曉晶，聶敏，孫梅勵(lì)

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科；衛(wèi)生部?jī)?nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730）

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一組由皮質(zhì)醇生物合成過程中某一種酶缺陷引起的常染色體隱性遺傳病。11β－羥化酶缺陷癥（11β－Hydroxylase deficiency，11β－OHD）是僅次于21－羥化酶缺陷癥（21α－OHD）引起CAH的第二大病因，約占CAH的5%～8%。其在普通人群中的發(fā)病率為1／100，000～1／200，000活產(chǎn)兒，而在近親結(jié)婚較普遍的從摩洛哥移民到以色列的猶太人群中，發(fā)病率高達(dá)1／7，000～1／5，000活產(chǎn)兒［1］。

11β－OHD 是由 CYP11B1基因突變所致，CYP11B1基因突變使P450c11B1的11β－羥化酶活性受損，11－去氧皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)醇受阻，合成皮質(zhì)醇的前體物質(zhì)：11－去氧皮質(zhì)酮（DOC）、17－羥孕酮等大量堆積，同時(shí)轉(zhuǎn)而合成過多的雄激素。血清高水平的DOC由于其具有弱鹽皮質(zhì)激素的作用，導(dǎo)致水鈉潴留，血容量增加，抑制腎素的合成，造成約2／3的經(jīng)典型11β－OHD患者有低腎素性高血壓［2］；而過多的雄激素引起男性患兒性早熟以及女性外生殖器男性化。然而，非經(jīng)典型11β－OHD患者，血壓一般正常或僅有輕度升高，女性患者出生時(shí)外生殖器正常，青春期前后可出現(xiàn)陰蒂肥大等雄激素過多癥狀，成年婦女可有多毛、月經(jīng)稀發(fā)等表現(xiàn)。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)新生兒優(yōu)生優(yōu)育的重視，目前有關(guān)CYP11B1基因新突變位點(diǎn)的報(bào)道增多并隨之對(duì)其功能的研究亦逐漸增加。本文將綜述11β－羥化酶缺陷癥分子遺傳學(xué)的研究現(xiàn)狀。

一、11β－OHD分子遺傳基礎(chǔ)

11β－OHD為常染色體隱性遺傳病，其致病基因?yàn)镃YP11B1。CYP11B1定位于8號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶（8q12），總長(zhǎng)度為6.03kb，共含有9個(gè)外顯子，編碼由503個(gè)氨基酸組成的P450c11B1蛋白；CYP11B2編碼醛固酮合成酶，位于CYP11B1上游約45kb處，與CYP11B1具有高度同源性，二者的外顯子和內(nèi)含子的相似度分別高達(dá)95%和90%，兩者的主要區(qū)別在于CYP11B2基因第5內(nèi)含子多插入442個(gè)堿基對(duì)［3］。CYP11B1基因突變，使11β－羥化酶活性減弱或喪失，導(dǎo)致11β－羥化酶缺陷癥。White等［4］于1991年首次報(bào)道了CYP11B1基因突變（R448H）引起11β－OHD。到目前為止，文獻(xiàn)報(bào)道的CYP11B1基因突變已達(dá)70余種，包括錯(cuò)義突變、無義突變、插入、缺失以及剪切位點(diǎn)的突變等，這些突變位點(diǎn)在所有外顯子區(qū)均有分布，但主要集中在第2、3、6、7、8外顯子區(qū)［3］（圖1），推測(cè)與這些外顯子區(qū)富含GpC位點(diǎn)以及其所對(duì)應(yīng)的氨基酸相對(duì)保守有關(guān)。我室對(duì)12例就診于北京協(xié)和醫(yī)院，初步診斷為11β羥化酶缺陷癥的患者行CYP11B1基因突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了9種CYP11B1基因新突變，包括4種錯(cuò)義突變，2種無義突變以及剪切位點(diǎn)突變，純合插入突變和缺失突變各一種，且主要集中在第3和第8外顯子區(qū)（文章待發(fā)表），與已報(bào)道的研究［3］結(jié)果一致。

圖1 已知CYP11B1基因突變類型簡(jiǎn)圖

二、CYP11B1基因突變對(duì)P450c11B1酶活性的影響

1.CYP11B1基因錯(cuò)義突變與酶活性：錯(cuò)義突變是CYP11B1基因突變最常見的類型，目前已報(bào)道50余種，主要通過蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬和體外蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)酶活性的影響。P450c11B1酶作為P450c11的一種，以血紅素為輔基催化氧化還原反應(yīng)，其三維結(jié)構(gòu)模擬圖（圖2）顯示I～L螺旋（helix）屬于高度保守的血紅素結(jié)合區(qū)，其中第450位的半胱氨酸（C450）巰基與血紅素鐵原子相結(jié)合，形成酶活性位點(diǎn)之一［3，5］，因此，C450鄰近的氨基酸改變，均會(huì)影響血紅素與酶的結(jié)合，使酶活性喪失。體外研究也證實(shí)，R427H、V441G、G444D、G446V、R448H、R453Q、R454C突變均使酶活性喪失［6－9］，其中R454C突變僅在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)。此外，I螺旋是底物“結(jié)合袋”的一部分，含有許多疏水性氨基酸以及潛在的酶活性位點(diǎn)，參與底物的識(shí)別與結(jié)合，研究顯示I螺旋構(gòu)像輕微的改變，即可導(dǎo)致P450c11B1酶活性嚴(yán)重受損［10］。脯氨酸取代亮氨酸（L299P）改變了I螺旋的空間位置，血紅素極性與非極性部分的空間位置也發(fā)生重排，使酶活性降至（1.6±0.8）%［11］。368位的丙氨酸（A368）與V336、L340相互作用維持其周圍的疏水環(huán)境，酸性天冬氨酸取代中性丙氨酸（A368D）同樣會(huì)改變I螺旋的構(gòu)像，使酶活性降至（1.17±1.9）%［10］。同理，P94L改變K－L環(huán)的方向［10］；位于K螺旋、I螺旋的A331V、E371G突變改變了酶的3級(jí)結(jié)構(gòu)［12］，均使酶活性喪失。

F和G螺旋以及G螺旋和I螺旋間的B－C環(huán)是底物進(jìn)入酶活性中心與其結(jié)合的潛在通道，尤其G螺旋是底物初始識(shí)別所必需的。A259位于G螺旋，A259D突變打破了丙氨酸周圍的疏水環(huán)境，使酶與底物的結(jié)合障礙，酶活性受損［6］。W116位于B－C環(huán)，116位色氨酸被取代，同樣使酶與底物結(jié)合受阻，酶活性喪失，目前發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)有 W116X、W116G、W116C三種突變［13］，高度保守的 T318同樣已發(fā)現(xiàn) T318R、T318M、T318P三種突變［12］，表明W116和T318位點(diǎn)可能不穩(wěn)定，易于發(fā)生突變。此外，V129M、V148G、R384Q、R384G等突變均因影響了酶與底物的結(jié)合，使酶活性下降。

總之，CYP11B1基因錯(cuò)義突變均不同程度的影響了P450c11B1酶的空間構(gòu)象，尤其是維持酶活性關(guān)鍵區(qū)的構(gòu)象，從而影響了酶活性。對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)的模擬將有助于合理解釋和進(jìn)一步證實(shí)體外蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果。

2.CYP11B1基因無義突變和框移突變與酶活性：目前已報(bào)道10余種CYP11B1基因無義突變。無義突變使終止密碼子提前出現(xiàn)，蛋白質(zhì)翻譯提前終止，導(dǎo)致截短蛋白產(chǎn)生，若維持酶活性的重要氨基酸（如血紅素結(jié)合區(qū)的第443位至463位之間氨基酸）缺失，將使酶活性喪失。已發(fā)現(xiàn)的CYP11B1基因無義突變均使血紅素結(jié)合區(qū)的氨基酸缺失。

圖2 P450c晶體結(jié)構(gòu)［5］

插入或缺失突變使閱讀框架移動(dòng)，相應(yīng)的氨基酸序列改變，翻譯出錯(cuò)誤蛋白，同時(shí)提前出現(xiàn)終止密碼子，蛋白表達(dá)提前終止，使酶蛋白的相應(yīng)功能結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變或缺失，酶活性喪失。如最新報(bào)道的框移突變g.2697del449、c.652－653insT、g.4671－4672insG、c.1359－1360insG分別使第165位的丙氨酸、218位的絲氨酸、404位精氨酸和第454位精氨酸分別轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼帷⒈奖彼?、脯氨酸和丙氨酸，并且蛋白表達(dá)分別于第217、258、421和468位提前終止［1，14－16］，高度保守的血紅素結(jié)合區(qū)氨基酸缺失或改變，酶活性喪失。

3.CYP11B1基因剪切位點(diǎn)突變與酶活性：關(guān)于CYP11B1基因剪切位點(diǎn)突變的報(bào)道較少。剪切位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致mRNA成熟前的錯(cuò)誤剪切，可以表現(xiàn)為原有的剪切信號(hào)（5’GT－AG3’）隱藏、潛在的剪切位點(diǎn)激活形成新的剪切位點(diǎn)或直接跳過整個(gè)外顯子在下一個(gè)外顯子剪切信號(hào)處剪切等，從而形成錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)錄本，表達(dá)出錯(cuò)誤蛋白，使酶活性喪失。如IVS8＋4A＞G突變，剪切時(shí)跳過第8外顯子，使成熟的mRNA缺乏第8外顯子，酶活性喪失。同理，IVS7＋4A＞G、IVS7－9C＞A、IVS5＋2T＞G等剪切位點(diǎn)的突變［5，15，17］，均因錯(cuò)誤剪切而使酶活性喪失。

4.CYP11B1基因嵌合突變與酶活性：由于CYP11B1與CYP11B2基因高度同源，減數(shù)分裂時(shí)，兩者可發(fā)生不平等等位基因交換，產(chǎn)生CYP11B2－CYP11B1嵌合基因，其啟動(dòng)子區(qū)由CYP11B2提供，受血管緊張素II（AngⅡ）和K＋的調(diào)節(jié)，盡管體外研究顯示，該嵌合基因編碼的蛋白質(zhì)具有11β－羥化酶的活性，但由于CYP11B2只在腎上腺球狀帶表達(dá)，因此，不能催化束狀帶11－去氧皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)醇。若患者為CYP11B2－CYP11B1嵌合基因純合子或?yàn)楹蠧YP11B2－CYP11B1嵌合基因的復(fù)合雜合子，則表現(xiàn)為11β－羥化酶缺陷癥。目前，共報(bào)道了3例由CYP11B2－CYP11B1嵌合基因引起的11β－OHD。Hampf 等［18］首次報(bào)道了一例攜帶CYP11B2－CYP11B1嵌合基因的復(fù)合雜合子患者，CYP11B2－CYP11B1嵌合基因由CYP11B2的1～4外顯子和CYP11B1的5～9外顯子組成，該患者另一條等位基因攜帶IVS3＋16G＞T剪切位點(diǎn)突變；Kuribayashi 等［19］報(bào)道一例高加索患者為CYP11B2－CYP11B1／G314R復(fù)合雜合子，嵌合基因由CYP11B2的1～3外顯子和CYP11B1的4～9外顯子組成；另一例為CYP11B2－CYP11B1純合突變患者，該嵌合基因由CYP11B2的1～6外顯子和CYP11B1的7～9外顯子組成［20］。對(duì)臨床表現(xiàn)符合11β－羥化酶缺陷癥的患者，如果用正常引物無法擴(kuò)增出CYP11B1基因，應(yīng)想到CYP11B2－CYP11B1純合突變的可能性。

5.基因型與表型關(guān)系：非經(jīng)典型11β－OHD患者可無或有輕度高血壓，或有輕度的雄激素過多的表現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)這些患者不典型的臨床表現(xiàn)與其CYP11B1基因突變對(duì)酶活性的影響相對(duì)較小有關(guān)。Joehrer等［21］首次對(duì)兩例非經(jīng)典型11β－OHD 患者進(jìn)行了分子遺傳學(xué)研究，該兩例患者分別為N133H／T319M和P42S／Y423X復(fù)合雜合子，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P42S、N133H、T319M突變使酶活性保留15%～40%。此后，Peters等［22］報(bào)道了一例L489S純合突變的非經(jīng)典型患者，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果示L489S僅輕度改變了酶與底物的親和力。2010年，Parajes等［13］在非經(jīng)典型患者中檢測(cè)到的M88I、P159L突變分別使酶活性下降至野生型的40%和25%。而研究顯示，引起經(jīng)典型11β－OHD的CYP11B1突變通常使酶活性下降至5%以下或使酶活性完全喪失，但對(duì)于每個(gè)特定突變，其與患者臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性，攜帶相同基因突變的不同患者，可有輕度或重度高血壓，雄激素過多的表現(xiàn)也輕重度不等。因此，基因型與表型之間的相關(guān)性，尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，11β－OHD為CAH第二常見類型，它是由CYP11B1基因突變引起的常染色體隱性遺傳病，男性化和高血壓為經(jīng)典型患者主要的臨床表現(xiàn)。目前，有關(guān)CYP11B1基因突變位點(diǎn)的報(bào)道已達(dá)70余種，基因突變對(duì)酶活性影響的研究也逐步深入。盡管研究發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典型患者的CYP11B1基因突變對(duì)酶活性的影響相對(duì)較小，但對(duì)于某個(gè)特定CYP11B1基因突變，其與患者臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性。對(duì)CYP11B1基因突變及其功能的深入研究，將有助于進(jìn)一步揭示基因型與表型的關(guān)系，同時(shí)也為產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢提供重要的依據(jù)，以提高嬰兒的優(yōu)生優(yōu)育水平。

［1］Ben C I，Riepe F G，Kahloul N，et al.Two novel CYP11B1 mutations in congenital adrenal hyperplasia due to steroid 11beta hydroxylase deficiency in a Tunisian family［J］.Gen Comp Endocrinol，2012，175：514－518.

［2］Kharrat M，Trabelsi S，Chaabouni M，et al.Only two mutations detected in 15Tunisian patients with 11betahydroxylase deficiency：the p.Q356Xand the novel p.G379V［J］.Clin Genet，2010，78：398－401.

［3］Nguyen HH，Nguyen TH，Vu CD，et al.Novel homozygous p.Y395Xmutation in the CYP11B1gene found in a Vietnamese patient with 11beta－h(huán)ydroxylase deficiency［J］.Gene，2012，509：295－297.

［4］White PC，Dupont J，New MI，et al.A mutation in CYP11B1（Arg－448－His）associated with steroid 11beta－h(huán)ydroxylase deficiency in Jews of Moroccan origin［J］.J Clin Invest，1991，87：1664－1667.

［5］Anzenbacher P，Anzenbacherová E，Lange R，et al.Active sites of cytochromes P450：What are they like？［J］.Acta Chim Slov，2008，55：63－66.

［6］Chabraoui L，Abid F，Menassa R，et al.Three novel CYP11B1 mutations in congenital adrenal hyperplasia due to steroid 11Beta－h(huán)ydroxylase deficiency in a moroccan population［J］.Horm Res Paediatr，2010，74：182－189.

［7］Wu C，Zhou Q，Wan L，et al.Novel homozygous p.R454C mutation in the CYP11B1gene leads to 11beta－h(huán)ydroxylase deficiency in a Chinese patient［J］.Fertil Steril，2011，95：1122－1123.

［8］Krone N，Grotzinger J，Holterhus PM，et al.Congenital adrenal hyperplasia due to 11－h(huán)ydroxylase deficiency－insights from two novel CYP11B1mutations（p.M92X，p.R453Q）［J］.Horm Res，2009，72：281－286.

［9］Ye ZQ，Zhang MN，Zhang HJ，et al.A novel missense mutation，GGC（Arg454）＞TGC（Cys），of CYP11B1gene identified in a Chinese family with steroid 11beta－h(huán)ydroxylase deficiency［J］.Chin Med J（Engl），2010，123：1264－1268.

［10］Krone N，Grischuk Y，Muller M，et al.Analyzing the functional and structural consequences of two point mutations（P94Land A368D）in the CYP11B1gene causing congenital adrenal hyperplasia resulting from 11－h(huán)ydroxylase deficiency［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91：2682－2688.

［11］Riedl S，Nguyen HH，Clausmeyer S，et al.A homozygous L299Pmutation in the CYP11B1gene leads to complete virilization in 46，XX individuals with 11－beta－h(huán)ydroxylase deficiency［J］.Horm Res，2008，70：145－149.

［12］Zhao LQ，Han S，Tian HM.Progress in molecular－genetic studies on congenital adrenal hyperplasia due to 11betahydroxylase deficiency［J］.World J Pediatr，2008，4：85－90.

［13］Parajes S，Loidi L，Reisch N，et al.Functional consequences of seven novel mutations in the CYP11B1gene：four mutations associated with nonclassic and three mutations causing classic 11｛beta｝－h(huán)ydroxylase deficiency［J］.J Clin Endocrinol Metab，2010，95：779－788.

［14］Xu C，Qiao J，Liu W，et al.Identification and functional characterization of a large deletion of the CYP11B1gene causing an 11beta－Hydroxylase deficiency in a Chinese pedigree［J］.Horm Res Paediatr，2012，78：212－217.

［15］Zhang M，Liu Y，Sun S，et al.A prevalent and three novel mutations in CYP11B1gene identified in Chinese patients with 11－beta hydroxylase deficiency［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2013，133：25－29.

［16］Soardi FC，Penachioni JY，Justo GZ，et al.Novel mutations in CYP11B1gene leading to 11beta－h(huán)ydroxylase deficiency in Brazilian patients［J］.J Clin Endocrinol Metab，2009，94：3481－3485.

［17］Dumic K，Wilson R，Thanasawat P，et al.Steroid 11－beta hydroxylase deficiency caused by compound heterozygosity for a novel mutation in intron 7（IVS 7DS＋4Ato G）in one CYP11B1allele and R448Hin exon 8in the other［J］.Eur J Pediatr，2010，169：891－894.

［18］Hampf M，Dao NT，Hoan NT，et al.Unequal crossing－over between aldosterone synthase and 11beta－h(huán)ydroxylase genes causes congenital adrenal hyperplasia［J］.J Clin Endocrinol Metab，2001，86：4445－4452.

［19］Kuribayashi I，Nomoto S，Massa G，et al.Steroid 11－betahydroxylase deficiency caused by compound heterozygosity for a novel mutation，p.G314R，in one CYP11B1allele，and a chimeric CYP11B2／CYP11B1in the other allele［J］.Horm Res，2005，63：284－293.

［20］Nimkarn S，New MI.Steroid 11beta－h(huán)ydroxylase deficiency congenital adrenal hyperplasia［J］.Trends Endocrinol Metab，2008，19：96－99.

［21］Joehrer K，Geley S，Strasser－Wozak EM，et al.CYP11B1 mutations causing non－classic adrenal hyperplasia due to 11 beta－h(huán)ydroxylase deficiency［J］.Hum Mol Genet，1997，6：1829－1834.

［22］Peters CJ，Nugent T，Perry LA，et al.Cosegregation of a novel homozygous CYP11B1mutation with the phenotype of nonclassical congenital adrenal hyperplasia in a consanguineous family［J］.Horm Res，2007，67：189－193.