談益芬 唐艷麗 王勝香 郭錦錦 李 均 孫萬邦

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，珠海519041)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的自身免疫性疾病，病因尚不清楚，其主要病變部位在關(guān)節(jié)滑膜，滑膜細(xì)胞類腫瘤樣增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、新生血管生成，進(jìn)而形成血管翳，造成關(guān)節(jié)的畸形和功能的喪失[1，2]。近年來有研究提示血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3，MMP-3)在RA滑膜炎癥、血管新生、血管翳的形成及軟骨與骨的破壞這一系列過程中可能起到關(guān)鍵性作用。中藥組方NDRF是由羌活(Notopterygium incisium Ting)、獨(dú)活(Doubleteeth pubescent angelica root)、防 風(fēng) (Radix sileris)和 木 瓜 (Fructus chaenomelis)為主藥，共由14味藥組成，主要藥理作用為祛風(fēng)除濕、補(bǔ)氣溫陽活血，本組方在臨床治療RA患者具有較好的療效，但缺乏理論依據(jù)，為探討NDRF治療機(jī)制并指導(dǎo)臨床應(yīng)用，本課題組采用此組方及聯(lián)合甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)對(duì)家兔佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis，AA)動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。前期研究表明弗氏佐劑聯(lián)合TNF-α改良方法造模能提高家兔AA模型成模率，中藥組方NDRF及聯(lián)合MTX能改善AA家兔滑膜組織病理損害，抑制IL-6、IL-8的表達(dá)作用[3]。本文通過檢測(cè)治療后家兔滑膜組織 MMP-3、VEGF細(xì)胞因子及其mRNA的變化，探討其藥物作用及機(jī)制，為中藥NDRF組方及聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 清潔級(jí)新西蘭白兔50只，雌雄各半，體重為(2.30±0.50)kg，由遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;弗氏完全佐劑(Complete freund adjuvant，CFA)Sigma公司產(chǎn)品;8%硫化鈉脫毛劑(Na2S)，本室配制;腫瘤壞死因子(TNF-α)上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 甲氨蝶呤由廣東嶺南制藥有限公司提供;中藥NDRF組方由羌活、獨(dú)活、防風(fēng)和木瓜為主藥，包括白芍、威靈仙、伸筋草、白芷、茯苓、土茯苓、丹參、千斤拔、桑枝和川斷等14味藥組成，由遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院李均博士提供。

1.3 試劑盒及主要儀器 MMP-3、VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒為上海江萊生物制藥有限公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀(ELx-800)為美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品，ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，凝膠圖像分析系統(tǒng)為PC gene公司產(chǎn)品。

1.4 佐劑性關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)及治療方案 新西蘭白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，足爪剃毛，稱體重，在伸直體位測(cè)膝關(guān)節(jié)周徑，采用隨機(jī)抓取的方法分為正常組(8只)和造模組(42只)，按文獻(xiàn)[3]的方法造模及進(jìn)行治療。

1.5 采集滑膜液及滑膜組織標(biāo)本 家兔處死后立即于膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射無菌生理鹽水0.3 ml，無菌手術(shù)打開關(guān)節(jié)腔，抽取關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜液0.3 ml，各家兔關(guān)節(jié)滑膜液分別裝入Eppendorf管中，-20℃低溫冰箱保存待測(cè)細(xì)胞因子。抽取關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜液后，打開膝關(guān)節(jié)腔，用眼科直鑷鈍性分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，完整剝離滑膜組織完整剪下，分別將所取滑膜組織迅速放入液氮罐中保存。

1.6 ELISA法檢測(cè)滑膜液MMP-3、VEGF的水平操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，全自動(dòng)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(A值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的A值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)MMP-3、VEGF mRNA的表達(dá)水平

1.7.1 引物序列(Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì))由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。見表1。

1.7.2 隨機(jī)取幾個(gè)樣品，加入相應(yīng)引物及SYBR green I進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定反應(yīng)條件如下:Real-time PCR 20 μl反應(yīng)體系為 cDNA 1 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，PCR mix 10 μl，ddH2O 7 μl。將反應(yīng)體系置于Real-time PCR儀上作用，反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃，2 min，變性 95℃，10 s，退火、延伸 60℃，40 s，共40個(gè)循環(huán);確定合適的PCR循環(huán)條件后，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次。觀察擴(kuò)增結(jié)果，看Ct值和擴(kuò)增曲線。用Real-time PCR相對(duì)定量的計(jì)算方法，計(jì)算出2-(△△Ct)以反映目的基因(相對(duì)于正常對(duì)照組)的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0版軟件，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，差異顯著性采用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)間相關(guān)性采用pearson檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA家兔滑膜液 MMP-3、VEGF細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 模型組與正常對(duì)照組比較，模型組MMP-3、VEGF細(xì)胞因子水平比正常對(duì)照組明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);治療組與模型組比較，三個(gè)治療組MMP-3、VEGF細(xì)胞因子水平比模型組均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與西藥MTX組比較，中藥 NDRF組、聯(lián)合組 MMP-3、VEGF細(xì)胞因子水平均低于西藥MTX組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);聯(lián)合組與中藥NDRF組比較，聯(lián)合組MMP-3、VEGF細(xì)胞因子水平均低于中藥NDRF組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果見表2。

表1 PCR引物序列Tab．1 The primer sequence for GAPDH，MMP-3 and VEGF

表2 AA家兔滑膜液 MMP-3、VEGF細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果(n=8，±s)Tab．2 The MMP-3 and VEGF changes on the AA Rabbits'synovial(n=8，±s)

Note:Compared with Normal control，1)P ＜ 0.01;compared with Model，2)P ＜0.05，3)P ＜0.01;compared with MTX，4)P ＜0.01;compared with NDRF，5)P ＜0.05，6)P ＜0.01.

Groups Treatment MMP-3(μg/L) VEGF(ng/L)A Normal control 5.91±0.41 99.79±10.19 B Model 13.39±2.791) 212.00±18.871)C NDRF 7.66±1.203)4) 105.34±14.183)4)D MTX 11.84±0.622) 174.45±35.482)E NDRF+MTX 5.97±0.883)4)5) 85.20±5.683)4)6)

表3 AA家兔滑膜組織MMP-3、VEGFmRNA檢測(cè)結(jié)果(n=8，±s)Tab．3 The MMP-3 mRNA and VEGFmRNA changes on the AA Rabbits'synovial(n=8，±s)

表3 AA家兔滑膜組織MMP-3、VEGFmRNA檢測(cè)結(jié)果(n=8，±s)Tab．3 The MMP-3 mRNA and VEGFmRNA changes on the AA Rabbits'synovial(n=8，±s)

Note:Compared with Normal control，1)P ＜0.01;compared with Model，2)P ＜0.05，3)P ＜ 0.01;compared with MTX，4)P ＜0.01;compared with NDRF，5)P ＜0.01.

Groups Treatment MMP-3 ΔCt 2-(ΔΔCt)VEGF ΔCt 2-(ΔΔCt)A Normal control 10.148±0.054 1 10.344±0.1621 0.549 B Model 8.856±0.0551) 2.448 8.735±0.1341) 3.050 C NDRF 12.157±0.0073)4) 0.249 10.257±0.1283)4) 1.062 D MTX 10.388±0.0083) 0.847 9.033±0.0152) 2.489 E NDRF+MTX 13.659±0.0053)4)5) 0.088 11.209±0.1093)4)5)

2.2 AA家兔滑膜組織MMP-3 mRNA、VEGF mRNA基因的檢測(cè)結(jié)果 模型組與正常對(duì)照組比較，模型組 MMP-3 mRNA(2-(△△Ct)值)、VEGF mRNA(2-(△△Ct)值)明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);治療組與模型組比較，三個(gè)治療組均比模型組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與西藥MTX組比較，中藥NDRF組、聯(lián)合組均低于西藥 MTX組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);聯(lián)合組與中藥NDRF組比較，聯(lián)合組均低于中藥NDRF組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果見表3。

2.3 AA家兔滑膜組織MMP-3與滑膜MMP-3 mRNA水平相關(guān)性 AA家兔滑膜組織MMP-3的值分別與滑膜MMP-3 mRNA表達(dá)水平的相對(duì)定量值進(jìn)行線性相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)系數(shù)r=0.655，雙側(cè)pearson檢驗(yàn)P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見AA家兔滑膜組織MMP-3的含量與滑膜MMP-3 mRNA表達(dá)水平有密切的相關(guān)性，且存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.4 AA家兔滑膜組織VEGF與滑膜VEGF mRNA水平相關(guān)性 AA家兔滑膜組織VEGF的值與滑膜VEGF mRNA表達(dá)水平的相對(duì)定量值進(jìn)行線性相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)系數(shù)r=0.905，雙側(cè)pearson檢驗(yàn)P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見AA家兔滑膜組織VEGF的含量與滑膜VEGF mRNA表達(dá)水平有密切的相關(guān)性，且存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆远嘞到y(tǒng)炎癥性的自身免疫性疾病。RA的基本病理改變是滑膜炎，進(jìn)而出現(xiàn)滑膜血管增生并伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)形成血管翳，導(dǎo)致關(guān)節(jié)黏連，最后出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞等病理改變。有研究表明，過度增生滑膜細(xì)胞及滑膜組織中浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞可能通過分泌大量細(xì)胞因子和蛋白酶，參與RA的發(fā)病和發(fā)展過程[4]。

由于RA病因尚未清楚，臨床治療棘手，目前西藥能短期緩解RA炎癥，但不能阻止病情的進(jìn)展，需要長(zhǎng)期治療，由于副作用明顯，患者難以堅(jiān)持治療;抗TNF-α單抗等生物制劑治療效果較好，但其價(jià)格昂貴，應(yīng)用受限。由于沒有理想治療藥物，中醫(yī)藥治療的研究成為了近年研究的熱點(diǎn)。RA屬中醫(yī)痹證范疇，許多中藥方劑具有控制炎癥和免疫調(diào)節(jié)等多方面的作用，且可以長(zhǎng)期服藥[5]。本研究采用的是李均博士在臨床實(shí)踐中總結(jié)的中藥NDRF組方，為祛風(fēng)除濕，補(bǔ)氣溫陽活血的獨(dú)創(chuàng)性組方，由羌活、獨(dú)活、防風(fēng)和木瓜為主藥，主要功效為祛風(fēng)勝濕，補(bǔ)氣溫陽活血，散寒止痛，臨床上治療RA具有較好療效。MTX是臨床上較早使用的抗風(fēng)濕藥，其療效確定，服用方便，價(jià)格低廉被認(rèn)為是治療RA的金標(biāo)準(zhǔn)，但其胃腸道反應(yīng)等副作用明顯，多數(shù)患者難以耐受。為研究中藥NDRF組方的藥物作用及機(jī)制，探索積極有效的治療方案，本課題組唐艷麗[3]發(fā)現(xiàn)中藥NDRF及聯(lián)合MTX治療AA家兔關(guān)節(jié)沒有明顯病理損傷，本研究從致骨關(guān)節(jié)損傷分子及基因變化方面闡述中藥NDRF的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

近年研究表明血管新生和血管翳的形成在RA的發(fā)生發(fā)展過程中起了非常重要的作用[6，7]。VEGF是目前已知作用最強(qiáng)的促血管新生的細(xì)胞因子，VEGF與其受體(VEGFR)特異性結(jié)合，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)炎癥反應(yīng)和新生血管的形成等多重作用，參與RA的發(fā)病機(jī)制與病理改變等[8-10]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)是一組在結(jié)構(gòu)上具有極大同源性，能降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的內(nèi)肽酶的總稱[11]。其中MMP-3屬于基質(zhì)分解素類，是MMPs中導(dǎo)致軟骨降解最重要的蛋白酶，可直接降解不同的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分，最終導(dǎo)致軟骨與骨組織的基質(zhì)成分的破壞。在RA致病過程中，MMP-3不僅降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分，而且可促進(jìn)血管翳對(duì)軟骨的侵蝕，在RA骨與軟骨的破壞過程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明，AA家兔模型滑膜組織MMP-3、VEGF細(xì)胞因子含量均明顯增高，其mRNA的相對(duì)含量也明顯增高，說明造模成功，同時(shí)也表明MMP-3、VEGF在 AA致炎中起重要作用;經(jīng)中藥NDRF及MTX治療后，三個(gè)治療組滑膜組織MMP-3、VEGF細(xì)胞因子含量及其mRNA相對(duì)含量均不同程度降低，其中聯(lián)合組降低最為明顯，其次為中藥NDRF組、西藥 MTX組，提示中藥 NDRF可降低MMP-3、VEGF蛋白與基因的表達(dá)，且聯(lián)合MTX的效果更為顯著。分析以上結(jié)果，可見中藥NDRF抑制致炎反應(yīng)與MMP-3、VEGF的下調(diào)相關(guān)，為中藥NDRF對(duì)AA的治療提供了作用靶點(diǎn)，推測(cè)中藥NDRF及聯(lián)合MTX可能通過降低細(xì)胞因子VEGF水平，減輕細(xì)胞因子對(duì)滑膜細(xì)胞的刺激，同時(shí)減少M(fèi)MP-3的分泌，從而抑制滑膜細(xì)胞的過度增生，抑制血管翳的形成，減輕軟骨與骨的破壞，起到阻止關(guān)節(jié)炎病程進(jìn)展的作用。通過分析AA家兔滑膜組織MMP-3、VEGF與各自相應(yīng)mRNA水平相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者均具有良好的正相關(guān)關(guān)系。從機(jī)理上討論，中藥NDRF聯(lián)合MTX可能從基因水平影響MMP-3、VEGF的蛋白表達(dá)，這在我們進(jìn)行家兔X線影像學(xué)改變(待發(fā)表)，藥物治療前后在軟組織腫脹、骨侵蝕和關(guān)節(jié)間隙改變的評(píng)分方面看到相同的規(guī)律。

綜上所述，本研究結(jié)果表明 MMP-3、VEGF在AA模型的發(fā)病和關(guān)節(jié)損傷中起著重要作用;中藥NDRF可降低AA家兔滑膜組織中MMP-3、VEGF的產(chǎn)生，且聯(lián)合MTX作用更為明顯，說明中藥組方NDRF及聯(lián)合MTX可以減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制滑膜組織增生，減輕軟骨與骨的破壞，對(duì)AA家兔模型起到治療作用，本研究為進(jìn)一步探討中藥及中西醫(yī)結(jié)合治療RA的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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