嚴(yán) 明 劉宇思 張 帥 胥文春 王 虹 張雪梅

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

佐劑是一種免疫增強(qiáng)劑可以擴(kuò)大機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答能力，自二十世紀(jì)20年代以來，許多物質(zhì)被作為免疫佐劑進(jìn)行研究。鋁佐劑是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于人的佐劑，也是目前人類疫苗最常用的佐劑，但其主要誘導(dǎo)體液免疫，抗體亞型以IgG1為主，對(duì)細(xì)胞免疫的促進(jìn)能力弱［1］。弗氏佐劑能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，但是其具有組織損傷、致癌等毒性反應(yīng)，不適合作為人類疫苗的組成成分［2］。隨著疫苗種類的不斷豐富，尤其是各種亞單位疫苗、蛋白疫苗的研發(fā)，新型佐劑的研究變得越來越重要［3，4］。

鞭毛蛋白是構(gòu)成細(xì)菌的鞭毛纖維的粒狀蛋白質(zhì)、具有較強(qiáng)的抗原性，它可被TLR5識(shí)別，并與其相結(jié)合誘導(dǎo)產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答和細(xì)胞因子的分泌，鞭毛蛋白作為天然免疫的誘導(dǎo)劑可以激活宿主免疫應(yīng)答從而顯示出佐劑效應(yīng)，目前已成為新型佐劑研究的熱點(diǎn)之一［5，6］。

肺炎鏈球菌是感染性疾病的重要病原體，主要威脅兒童和老年人的健康，疫苗是預(yù)防其感染的一個(gè)主要方式［7］。在本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在CT佐劑存在的情況下，鼻腔免疫肺炎鏈球菌DnaJ蛋白可以抵抗致死劑量的肺炎鏈球菌感染［8］。但CT佐劑具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，不能用于人類疫苗。因此，本研究將鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與肺炎鏈球菌DnaJ蛋白聯(lián)合免疫，觀察其免疫效應(yīng)及對(duì)小鼠感染肺炎鏈球菌的保護(hù)效果，為DnaJ蛋白疫苗的開發(fā)和鞭毛蛋白作為佐劑的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 DNA純化試劑盒(Roche)、DNA提取試劑盒(Qiangen)、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和SacⅠ(TaKaRa);T4-DNA連接酶(Progema公司產(chǎn)品);質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega公司產(chǎn)品);IPTG、丙烯酰胺(Sigma產(chǎn)品);咪唑、Tris、NaCl(BBI產(chǎn)品);His-Bind Column(Ni-NTA)柱(Novagen公司產(chǎn)品);HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG或IgA(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);IgG抗體亞型試劑盒(Santa公司);DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司);細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(Biolegend公司);哥倫比亞血平板(重慶龐統(tǒng)醫(yī)療器械有限公司);卡巴膽堿(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司);LB培養(yǎng)基及C+Y培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室配制。GST-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶［(是一種溶解性高的多肽，作為目的蛋白表達(dá)的載體，增加可溶性)購(gòu)于Novagen公司］。

1.1.2 菌種與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC7466(D39)購(gòu)買于英國(guó)國(guó)家菌種保藏管理中心(CMCC);鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14208由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng);E.coli BL21(DE3)菌株、質(zhì)粒 pET28(a)(本實(shí)驗(yàn)室保存);重組 DnaJ蛋白(本實(shí)驗(yàn)室保存［8］);SPF級(jí)C57BL/6小鼠、6～8周、雌性(由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)。

1.2 方法

1.2.1 傷寒沙門菌鞭毛蛋白基因的擴(kuò)增、克隆及序列鑒定 ATCC14208于LB培養(yǎng)基中增菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照試劑盒說明書提取基因組DNA，擴(kuò)增鞭毛蛋白的基因編碼區(qū)。引物由華大基因公司合成，序列如下:上游引物:GGAATTCCATATGGCACAAGTAATCAAC(下劃線為NdeⅠ酶切位點(diǎn));下游引物:CGAGCTCTTAACGTAACAGAGACAGCAC(下劃線為SacⅠ酶切位點(diǎn))。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳(1%的瓊脂糖凝膠)鑒定后，用DNA純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.2 鞭毛蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 純化后的PCR產(chǎn)物和pET28(a)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、SacⅠ進(jìn)行雙酶切，并用DNA純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物，然后用T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DE3感受態(tài)。挑取單個(gè)菌落行菌落PCR進(jìn)行陽(yáng)性篩選，陽(yáng)性菌落用試劑盒抽提質(zhì)粒后進(jìn)行NdeⅠ、SacⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定然后送往華大基因公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3 鞭毛蛋白的表達(dá)及純化 測(cè)序成功后根據(jù)本實(shí)驗(yàn)課題組方法挑取陽(yáng)性克隆接種LB培養(yǎng)液(含 50 μg/ml卡那霉素)37℃ 培養(yǎng)過夜［9，10］。次日將飽和培養(yǎng)物按1∶50接種至含相同卡那霉素濃度的LB培養(yǎng)液中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至OD(600)=0.5時(shí)加不同濃度IPTG，20℃、120 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)5、8、10 h;4℃離心收集菌體。將菌體用Binding buffer(含 500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris，pH=8.0)重懸后，進(jìn)行超聲破菌，然后離心后分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE電泳分析蛋白可溶性表達(dá)情況。收集超聲破菌后離心的上清液轉(zhuǎn)入經(jīng)Binding Buffer(成分如前所述)平衡后的Ni-NTA樹脂進(jìn)行純化。用含不同濃度咪唑的Washing Buffer梯度洗脫雜蛋白后用Elution Buffer(500 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH=8.0)洗脫目的蛋白。純化后目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，用PBS對(duì)目的蛋白進(jìn)行超濾除咪唑，待咪唑濃度超濾至1 mmol/L以下時(shí)進(jìn)行蛋白定量，分裝保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 小鼠鼻腔免疫 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成三組，分別為鞭毛蛋白組、DnaJ組及DnaJ與鞭毛蛋白混合組。用乙醚吸入麻醉小鼠后分別通過鼻腔滴入30 μl PBS(含10 μg相應(yīng)蛋白)，每周免疫一次，連續(xù)免疫三次。

1.2.5 黏膜免疫后小鼠特異性體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測(cè) 末次免疫1周后，取小鼠尾靜脈血(每組4只)，同時(shí)腹腔注射30 μl卡巴膽堿使小鼠產(chǎn)生唾液并收集;分離血清存于－20℃。用DnaJ蛋白(濃度為5 μg/ml)作為抗原包被96孔板小鼠血清作為一抗從1∶1 000開始稀釋到1∶5 120 000，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG及其個(gè)亞型作為二抗，通過間接ELISA的方法測(cè)血清總IgG及其亞型的效價(jià)。同理檢測(cè)唾液中特異性分泌型IgA的效價(jià)，具體如本實(shí)驗(yàn)室所做［9］。

末次免疫1周后，分別取三組小鼠各3只，分離獲取脾細(xì)胞。重懸于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，并加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，調(diào)整每孔細(xì)胞量為5×105個(gè)，實(shí)驗(yàn)孔加入5 μg的DnaJ蛋白，陰性對(duì)照孔加入同體積的 PBS，37℃，5%CO2，孵育;72 h后取細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-17A、IL-4、IL-10、IFN-γ水平，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 小鼠的主動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn) 在末次免疫兩周后，鼻腔感染5×107CFU的D39菌株，連續(xù)監(jiān)測(cè)小鼠生存狀態(tài)至21 d，計(jì)算生存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖和分析。組間抗體滴度及細(xì)胞因子的比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的兩樣本Student's t檢驗(yàn)，組間生存率比較用Log-rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傷寒沙門鞭毛蛋白基因的擴(kuò)增 以鼠傷寒沙門氏菌DNA為模板擴(kuò)增鞭毛蛋白目的基因，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見大小約1 500 bp左右的一條清晰條帶，與預(yù)期相符(圖1A)。

2.2 pET28a-Flagellin重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-28a(+)連接轉(zhuǎn)化DE3感受態(tài)，所得陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR及質(zhì)粒雙酶切鑒定，1%瓊脂糖電泳出現(xiàn)的條帶與目的片段大小一致(圖1B)。陽(yáng)性克隆送往公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Gen-Bank公布的序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 pET28a-Flagellin重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.1 Construction and double enzyme identification of recombinant expression plasmid

2.3 重組鞭毛蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 確定pET-28a(+)-Flagellin/DE3的最適合表達(dá)條件是:IPTG終濃度為0.1 mmol/L時(shí)，20℃、120 r/min誘導(dǎo)8 h、SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后全菌和上清均在分子量為52 kD左右出現(xiàn)一粗的蛋白條帶(與預(yù)期相符)，而未誘導(dǎo)全菌未出現(xiàn)(如圖2);將此上清經(jīng)Ni-NTA柱純化后，得到單一的目的蛋白，其純度經(jīng)凝膠掃描可見達(dá)95%以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 小鼠免疫后產(chǎn)生的特異性抗體及亞型 為排除總蛋白量增加以及重組蛋白殘留內(nèi)毒素可能帶來的影響，我們采用GST作為無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照，設(shè)置了單獨(dú)DnaJ蛋白組和DnaJ蛋白+GST蛋白組免疫小鼠，分別作為陰性對(duì)照1和2。間接ELISA結(jié)果顯示(如圖3)，陰性對(duì)照1和2免疫組小鼠的血清特異性IgG水平無(wú)顯著差異，而鞭毛蛋白與DnaJ蛋白聯(lián)合免疫組小鼠血清中特異的IgG抗體效價(jià)較二者顯著升高(P＜0.01)。抗體亞型檢測(cè)顯示，鞭毛蛋白與DnaJ蛋白聯(lián)合免疫小鼠后，血清中的IgG抗體亞型以IgG1為主，其次為IgG2a和IgG2b，未檢測(cè)到IgG3(如圖4)。

圖2 鞭毛蛋白純化前后SDS-PAGE的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of SDS-PAGE for flagellin

圖3 小鼠血清中特異抗體效價(jià)Fig.3 Special serum antibody titers of mouse

圖4 小鼠血清中抗體亞型效價(jià)Fig.4 Serum subtype antibody titers of mouse

圖5 小鼠唾液中特異性抗體效價(jià)Fig.5 Special antibody titers in saliva of mice

唾液IgA抗體水平檢測(cè)結(jié)果顯示，聯(lián)合免疫組小鼠唾液IgA抗體水平較陰性對(duì)照組升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(如圖5)。

2.5 細(xì)胞因子檢測(cè) 研究顯示，Th1、Th2和Th17型細(xì)胞免疫反應(yīng)可能參與肺炎鏈球菌疫苗的保護(hù)作用［10］，本研究檢測(cè)了相關(guān)的細(xì)胞因子:IFN-γ(Th1型)、IL-4、IL-10(Th2型)、IL-17A(Th17 型)。結(jié)果如圖6顯示，鞭毛蛋白與DnaJ蛋白聯(lián)合免疫組較DnaJ蛋白+GST蛋白免疫組和單獨(dú)DnaJ蛋白組產(chǎn)生了更高水平的 IFN-γ(P＜0.01)、IL-17A(P＜0.01)和IL-4(P＜0.01)，提示鞭毛蛋白可以增強(qiáng)DnaJ誘導(dǎo)的特異性Th1、Th2和Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答。

2.6 小鼠肺炎鏈球菌D39攻毒保護(hù)試驗(yàn) 末次免疫兩周后對(duì)三組小鼠鼻腔滴注致死劑量的肺炎鏈球菌D39(5×107CFU)，連續(xù)觀察21 d小鼠的保護(hù)效果。結(jié)果顯示，鞭毛蛋白與DnaJ混合組的生存率為60%，與單獨(dú)鞭毛蛋白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，也高于單獨(dú) DnaJ蛋白免疫組的生存率(50%)，提示鞭毛蛋白可以增強(qiáng)DnaJ蛋白誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫效應(yīng)(如圖7)。

圖6 免疫后小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子Fig.6 Cytokine levels in spleen cells of immunized mice

圖7 小鼠感染肺炎鏈球菌D39的生存率Fig.7 Survival rate against D39 infection

3 討論

肺炎鏈球菌是一種嚴(yán)重危害人們健康的病原體，而疫苗接種是預(yù)防其感染的一個(gè)有效方法［11］。隨著人們對(duì)不同類型的疫苗的研究，原有的佐劑也顯示出其局限性，因此新型佐劑的研究也變得十分迫切［12］。鞭毛蛋白是傷寒沙門氏菌細(xì)菌鞭毛的主要蛋白，是目前已知的TLR5唯一激動(dòng)劑，可以通過TLR5途徑激活宿主免疫應(yīng)答，研究表明鞭毛蛋白與抗原以不同方式融合后可以發(fā)揮佐劑作用［13］。但是融合蛋白可能對(duì)鞭毛蛋白本來的構(gòu)象產(chǎn)生影響，本研究主要將鞭毛蛋白與DnaJ蛋白聯(lián)合免疫小鼠，通過研究其與DnaJ蛋白聯(lián)合免疫對(duì)肺炎鏈球菌感染的保護(hù)作用來對(duì)鞭毛蛋白佐劑效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究成功表達(dá)與純化鞭毛蛋白，并將其與DnaJ蛋白聯(lián)合免疫C57BL/6小鼠(設(shè)置不同條件的對(duì)照組)，所有小鼠免疫3次后取鼠尾靜脈血和唾液。ELISA結(jié)果表明鞭毛蛋白與DnaJ蛋白聯(lián)合免疫可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較高劑量的IgG抗體，且IgG抗體亞型以IgG1為主同時(shí)產(chǎn)生一定量的IgG2a和IgG2b，說明鞭毛蛋白與DnaJ蛋白混合免疫時(shí)鞭毛蛋白有增強(qiáng)DnaJ蛋白免疫效應(yīng)的作用。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是大腸桿菌細(xì)菌內(nèi)毒素的主要毒性成分，具有致熱作用。通過大腸桿菌表達(dá)外源蛋白時(shí)，破菌收集蛋白時(shí)會(huì)混入大量的LPS，后續(xù)的親和層析純化步驟不能保證完全去除溶液中混有的LPS。有報(bào)道提示，LPS可以刺激機(jī)體免疫反應(yīng)，具有黏膜佐劑的能力［14］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了GST蛋白作為無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照，以排除LPS可能產(chǎn)生的干擾作用［15］。該對(duì)照同時(shí)也排除了蛋白量增多而產(chǎn)生的影響?？贵w效價(jià)檢測(cè)結(jié)果顯示，DnaJ+GST對(duì)照組誘導(dǎo)的特異性IgG水平與單獨(dú)DnaJ蛋白組無(wú)顯著差別，而DnaJ+鞭毛蛋白組的特異性IgG效價(jià)較二者顯著增高，這表明鞭毛蛋白確實(shí)能夠增強(qiáng)DnaJ的免疫原性，具有佐劑效應(yīng)。

為了進(jìn)一步研究其免疫增強(qiáng)效應(yīng)的類型，我們對(duì)不同免疫組的脾細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PBS對(duì)照組相比，鞭毛蛋白與DnaJ蛋白聯(lián)合與單獨(dú)DnaJ蛋白免疫組小鼠均檢測(cè)到了顯著升高的IL-4、IFN-γ和IL-17A;而聯(lián)合免疫組較單獨(dú)免疫組的細(xì)胞因子水平顯著增高，提示鞭毛蛋白發(fā)揮佐劑效應(yīng)可增強(qiáng)宿主的Th1、Th2及Th17免疫應(yīng)答。主動(dòng)性保護(hù)實(shí)驗(yàn)提示，鞭毛蛋白與DnaJ蛋白聯(lián)合免疫小鼠的生存率(60%)比DnaJ蛋白免疫組(50%)小鼠高，與單一的鞭毛蛋白免疫組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)表明鞭毛蛋白可以增強(qiáng)DnaJ蛋白誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)，提高宿主肺炎鏈球菌感染抵抗能力。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明:傷寒沙門氏菌的表面鞭毛蛋白具有佐劑作用，與DnaJ蛋白聯(lián)合免疫可以增強(qiáng)其誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)并提高宿主抵抗肺炎鏈球菌感染的能力。本研究為鞭毛蛋白作為蛋白疫苗佐劑的使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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