潘沛江 葉 力 陳 暉 黃頡剛 梁冰玉 蔣俊俊 廖艷研 李 彧 蘇錦明 陳榮鳳 梁 浩

(廣西艾滋病防治研究重點實驗室，廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南寧 530021)

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是將外源性基因?qū)胨拗骷毎蚪M內(nèi)，從而生成雙鏈RNA(dsRNA)，dsRNA被核酸內(nèi)切酶切割形成siRNA，后者在RNA聚合酶的輔助下，完成對信使RNA的沉默現(xiàn)象［1］，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因功能、基因治療等方面的研究［2］。目前，人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染面臨著無有效疫苗出現(xiàn)的嚴峻形勢，高效抗逆轉(zhuǎn)錄抗病毒治療(HAART)在降低艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)患者的發(fā)病率與死亡率方面發(fā)揮著不可替代的作用［3］，但是其導(dǎo)致的副作用同樣不容忽視［4］，Kumar等［5］認為 RNAi技術(shù)具有高效特異的特點而適用于AIDS基因治療。趙令齋等［6］研究發(fā)現(xiàn)HIV感染者單核細胞TLR2表達水平高于健康者，而TLR2信號通路的活化，可激活HIV病毒P38MAP激酶通路，進而促進HIV的轉(zhuǎn)錄復(fù)制［7］。那么通過抑制TLR2基因的表達是否能阻礙HIV的感染復(fù)制?對于TLRs基因的RNAi技術(shù)研究，目前國內(nèi)主要關(guān)注與急性炎癥高度相關(guān)的TLR4［8］，少有關(guān)于人單核巨噬細胞 TLR2基因的RNAi技術(shù)的研究報道。因此，本研究通過構(gòu)建TLR2 siRNA轉(zhuǎn)染人-單核巨噬細胞模型，研究siRNA對人-單核巨噬細胞TLR2基因及蛋白水平的影響，旨在為進一步深入研究TLR2的基因功能，探索HIV治療方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 Tgradient 96梯度PCR儀(德國BioMETRA公司);CFX 96TM實時定量PCR儀(美國Bio-RAD公司);PCR電泳儀(美國Bio-RAD公司);GBoxF3凝膠成像系統(tǒng)(英國SYNGENE公司);DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清FBS培養(yǎng)基(Gibco公司);Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄、Q-PCR試劑盒(TaKaRa公司);siRNA序列(英駿生物技術(shù)有限公司合成);鼠一抗(Abcam公司);HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 TLR2 siRNA序列設(shè)計與合成 在基因庫中尋找TLR2基因的mRNA序列，并從起始密碼后的第75位堿基開始尋找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19為任意19 nt的mRNA核苷酸序列;然后設(shè)計選定序列中的G+C的比例為30%～70%;對確定的序列用Blast搜尋EST基因庫，確定靶向的基因是唯一的;共獲得3條siRNA序列，由英駿生物技術(shù)有限公司合成。陽性對照為人類看家基因(GAPDH)siRNA，正 義 鏈 序 列:5’-GCCUCAAGAUCAUCAGCAAUU-3’，反義鏈序列:3’-UU CGGAGUUCUAGUAGUCGUU-5’;陰性對照為 6-羧基熒光素標(biāo)記的siRNA(NC-FAM)，正義鏈序列:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列:3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’。

1.2.2 人-單核巨噬細胞的分離和培養(yǎng) 經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會同意，在廣西醫(yī)科大學(xué)招募健康成人志愿者(20～30歲)，并采集其外周血作為樣本，對本實驗均知情同意。從血樣中分離純化單核細胞，在37℃、5%CO2條件下，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，48孔板培養(yǎng)7～10 d使其分化成巨噬細胞。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染 待單核細胞分化為巨噬細胞的比率達到或大于80%，可進行轉(zhuǎn)染。先予每孔250 μl 10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液過夜，1 μl Lipofectamine 2000與20 pmol siRNA形成轉(zhuǎn)染混合物，將其加入每孔與250 μl培養(yǎng)基混勻，37℃、5%CO2條件下轉(zhuǎn)染72 h，用TRIzol Reagent裂解細胞后提取RNA。

1.2.4 q-PCR測定目的基因的表達水平 每份標(biāo)本用等量RNA逆轉(zhuǎn)錄酶，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA模版。β-actin引物上游:5’-GGAG-ATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游:5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。GAPDH 引 物 上 游:5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，下游:5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’。TLR2引物上游:5’-GGCTTCTCTGTCTTGTGACC-3’，下游:5’-GGGCTTGAACCAGGAAGACG-3’。擴增條件:95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 3 s變性，60℃ 30 s退火及延伸，每個循環(huán)到此進行拍照，40個循環(huán)后，再于95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s條件溶解。采用q-PCR分析程序分析CT值，計算同一樣品其相應(yīng)△CT值，如目的基因CT值減去內(nèi)參β-actin的CT值即為△CT。以2－△CT表示目的基因mRNA的相對表達量，則siRNA組基因抑制率(RNAi%)=(1－siRNA 組2－△CT/陰性組2－△CT)×100%。

1.2.5 Western blot測定目的蛋白的表達水平 待樣本提取RNA后，從下層剩余液中提取蛋白，20 μl 1%SDS液溶解蛋白并測定濃度，加入5 μl的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸備用。采用SDSPAGE凝膠配制試劑盒完成制膠、上樣，進行SDSPAGE電泳，之后將蛋白轉(zhuǎn)到分子雜交膜(PVDF膜)。用含5%脫脂奶粉的封閉液(TBST配制)封閉1 h。4℃ 孵育過夜(1∶100稀釋，PBST 配制)，用PBST液震蕩漂洗10 min×3次，放入稀釋后的第二抗體(1∶2 000，PBST 配制)，4℃孵育 2 h，清洗后均勻滴入ECL發(fā)光劑，在FliorChem HD2成像系統(tǒng)進行掃描分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 每次實驗同一轉(zhuǎn)染條件重復(fù)2孔，合并為一樣本;實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件完成數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果以表示，多組間抑制率比較采用方差分析(Oneway ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗。ɑ=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 siRNA序列設(shè)計 根據(jù)設(shè)計原則，經(jīng)Blast查詢排除與其他基因同源的序列，去掉含有兩個及兩個以上SNPs位點的序列，選出3條符合設(shè)計的序列，見表1。

表13條TLR2基因siRNA序列Tab.1 Three siRNAs'sequence of TLR2 gene

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染效率 陽性對照GAPDH siRNA的抑制率用以檢測轉(zhuǎn)染效果，以2－△CT表示基因mRNA的相對表達量。PCR結(jié)果顯示，陽性對照組GAPDH mRNA表達明顯低于陰性對照組(t=－16.641，P＜0.001)，抑制率為42%。與陰性對照組比較，陽性對照組的GAPDH蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，如表2，圖1、2。

表2 陽性對照組GAPDH mRNA表達抑制率及分析結(jié)果Tab.2 Inhibition rate of GAPDH mRNA expression in positive control group

圖1 siRNA沉默后陽性對照組GAPDH蛋白的表達Fig.1 Expression of GAPDH protein in Pos.C after siRNA silencing

圖2 siRNA沉默后GAPDH/β-actin灰度比值Fig.2 Gray ratio of GAPDH/β-actin after siRNA silencing

2.3 TLR2 mRNA抑制效率 以2－△CT表示基因mRNA的相對表達量。轉(zhuǎn)染72 h后，PCR結(jié)果顯示，各組TLR2 mRNA表達水平整體差異有顯著性(F=41.957，P＜0.001)。與陰性對照組比較，siRNA各組的TLR2 mRNA表達水平均明顯降低(P＜0.05)，經(jīng)計算，三組的抑制率分別為46%、43%、43%，見表3。

表3 siRNAs組TLR2 mRNA表達抑制率及分析結(jié)果Tab.3 Inhibition rate of TLR2 mRNA expression in siRNA groups

2.4 TLR2 mRNA蛋白水平檢測 Western blot法檢測人-單核巨噬細胞轉(zhuǎn)染siRNA后TLR2蛋白的表達。與陰性對照組比較，siRNA各組的TLR2蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖 3、4。

圖3 siRNA沉默后siRNAs組TLR2蛋白的表達Fig.3 Expression of TLR2 protein in siRNA groups after siRNA silencing

圖4 siRNA沉默后TLR2/β-actin灰度比值Fig.4 Gray ratio of TLR2/β-actin after siRNA silencing

3 討論

TLR2受體屬模式識別受體家族中的一員，其在人多種免疫細胞表面表達豐富［9］，能夠識別病毒蛋白顆粒，啟動抗病毒免疫應(yīng)答［10］，利于病原體的清除。然而有研究認為，TLR2表達的增高對于HIV感染者往往是不利的。Heggelund等［11］研究認為，HIV感染者單核細胞中TLR2的表達增強，將會促進HIV的復(fù)制及相關(guān)炎癥反應(yīng)，Hernandez等［12］研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞 TLR2在 HAART后的 HIV-1感染者中表達有所下降。此外，Nordone等［13］對HIV-1慢性感染細胞模型施加 TLR2激動劑后，發(fā)現(xiàn)TLR2信號通路被激活后能進一步增強 HIV的復(fù)制，可能的機制是TLR2活化能激活信號通路的下游因子TNF-α及NF-κB，從而增強 HIV-1的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制［14，15］?？梢?TLR2信號通路活化與 HIV 復(fù)制密切相關(guān)。因此，本次研究選擇TLR2基因作為抑制對象，通過反向研究TLR2的功能，能夠為HIV自身免疫、抗感染治療提供新的切入點。

本實驗方法參照劉思蘭等研究［16］，采用陽離子脂質(zhì)體試劑Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑直接轉(zhuǎn)染人-單核巨噬細胞，本研究陽性對照 GAPDH siRNA抑制率為42%，與同類研究相似［17］，表明此方法在RNA抑制研究中具轉(zhuǎn)染效率高、重復(fù)性好、低毒性等良好效果。單核巨噬細胞作為HIV易感染的靶細胞，在HIV感染過程中起著十分重要的作用，因此我們應(yīng)用siRNA抑制人單核巨噬細胞TLR2的表達進行本次研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三條siRNA序列在人單核巨噬細胞中轉(zhuǎn)染效率高，且能夠有效抑制細胞TLR2的表達，說明本次采用的實驗方法可行，可為今后的研究奠定基礎(chǔ)。RNAi技術(shù)作為轉(zhuǎn)錄后基因沉默的強大工具，已有研究證實RNAi治療劑能夠靶向作用于疾病細胞［18］?；瘜W(xué)合成siRNA在哺乳動物體內(nèi)外能夠介導(dǎo)同源基因沉默，并具有治療作用［19］。Kumar等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在已建立的HIV/AIDS人源化小鼠模型基礎(chǔ)上，將siRNAs轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)后，其能夠明顯抑制HIV在外周血單個核細胞中的復(fù)制。Seema等［20］在體外對HIV/MTB共感染的CD4+T細胞應(yīng)用TLR2 siRNA+BCG，發(fā)現(xiàn)TLR2的表達降低后，能夠下調(diào)CD4+T細胞對HIV的敏感性，進而抑制HIV的復(fù)制。上述研究表明，通過抑制TLR2信號通路活化能夠抑制TLR2對HIV-1復(fù)制的促進作用，該機制已經(jīng)被嘗試用來研發(fā)免疫治療的新方法。

綜上所述，本研究從人TLR2基因出發(fā)設(shè)計siRNA序列，選取人單核巨噬細胞為靶細胞，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)三條siRNA均能夠抑制TLR2基因和蛋白的表達，阻斷TLR2信號通路的傳導(dǎo)。因此，siRNA介導(dǎo)的TLR2通路沉默對HIV具有潛在治療前景。然而，siRNA介導(dǎo)的基因治療技術(shù)，仍處在實驗研究階段，面臨著靶向細胞的識別、黏附、轉(zhuǎn)入等技術(shù)難題，此外，醫(yī)學(xué)倫理道德上存在的問題亦不容忽視［21］，是科學(xué)界今后研究的熱點也是面臨的難題之一。

［1］秦玉新，蒙凌華，丁健.RNA干擾技術(shù)的研究進展［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(4):421-424.

［2］范守城，張云茹.RNAi技術(shù)研究進展及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景［J］.微生物學(xué)雜志，2009，29(4):93-98.

［3］Walensky RP，Paltiel AD，Losina E，et al.The survival benefits of AIDS treatment in the United States［J］.J Infect Dis，2006，194:11.

［4］Hofman P，Nelson AM.The pathology induced by highly active antiretroviral therapy against human immunodeficiency virus:an update［J］.Curr Med Chem，2006，13:3121.

［5］Kumar P，Wu H，McBride JL，et al.Silencing HIV-1 In Vivo［J］.Cell，2008，134:566-568.

［6］趙令齋，陳偉烈，胡鳳玉，等.HIV/AIDS患者外周血白細胞TLR-1、-2、-4和-6表達的初步研究［J］.中國病毒病雜志，2011，1(5):354-357.

［7］Shapiro L，Heidenreich KA，Meintzer MK，et al.Role of p38 mitogen-activated protein kinase in HIV type 1 production in vitro［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(13):7422-7426.

［8］耿紅蓮，王愛華，陸慧琦，等.Toll樣受體4小干擾RNA表達載體的構(gòu)建及鑒定篩選［J］.中華實驗診斷學(xué)，2010，14(10):1509-1511.

［9］Bonfim CV，Mamoni RL，Blotta MH.TLR-2，TLR-4 and dectin-1 expression in human monocytes and neutrophils stimulated by Paracoccidioides brasiliensis［J］.Med Mycol，2009，47(7):722-733.

［10］楊芳芳.TOLL樣受體2的研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(11):1636-1639.

［11］Heggelund L，Muller F，Lien E，et al.Increased expression of Tolllike receptor 2 on monocytes in HIV infection-possible role in inflammation and viral replication［J］.Clin Infect Dis，2004，39:264-269.

［12］Hernandez J C，Stevenson M，Latz E，et al.HIV Type 1 Infection Up-Regulates TLR2 and TLR4 Expression and Function in Vivo and in Vitro［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2012，28(10):1313-1328.

［13］Nordone S K，Ignacio G A，Su L，et al.Failure of TLR4-driven NF-kappa B activation to stimulate virus replication in models of HIV type 1 activation［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2007，23(11):1387-1395.

［14］Ma X，Liu Y，Gowen B B，et al.Full-exon resequencing reveals toll-like receptor variants contribute to human susceptibility to tuberculosis disease［J］.PLoS One，2007，2(12):e1318.

［15］Ricci E，Malacrida S，Zanchetta M，et al.Toll-like receptor 9 polymorphisms influence mother-to-child transmission of human immunodeficiency virus type 1［J］.J Transl Med，2010，8:49.

［16］劉思蘭，楊建平，王麗娜，等.有效抑制小膠質(zhì)細胞上 TLR4表達的siRNA篩選及轉(zhuǎn)染復(fù)合物細胞毒性的檢測［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(4):457-461.

［17］Kong YC，Sun B，Zhao KX，et al.Small interference RNA targeting vascular endothelial growth factor gene effectively attenuates retinal neovascularization in mice model［J］.Chin Med J(Engl)，2013，126(8):1440-1444.

［18］Grimm D，Kay MA.Therapeutic application of RNAi:is mRNA targeting finally ready for prime time［J］.J Clin Invest，2007，117:3633-3641.

［19］Castanotto D，Rossi JJ.The promises and pitfalls of RNA—interference-based therapeutics［J］.Nature，2009，457:426-433.

［20］Seema MT，Ya-Chi H，Robert CB，et al.Mycobacterium tuberculosis complex enhances susceptibility of CD4 T cells to HIV through a TLR2-mediated pathway［J］.PLoS One，2012，7(7):e41093.

［21］楊 燦，郭 鑫，謝 軍.基因治療技術(shù)的倫理思考［J］.中國倫理學(xué)，2013，26(3):331-333.