劉建群，高俊博，舒積成，張 銳

（江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004）

邁克爾加成反應(yīng)［1］是親電的共軛體系與親核的負(fù)電體系進(jìn)行的共軛親核加成反應(yīng).一般來說，烯鍵或炔鍵與吸電子基團(tuán)共軛相連形成的官能團(tuán)可構(gòu)成親電共軛體系，含有該共軛體系的化合物稱為邁克爾反應(yīng)受體分子.邁克爾反應(yīng)受體分子具有許多重要的藥理活性，如酶抑制活性［2］，抗病毒活性［3］，抗炎活性［4］，醌還原酶誘導(dǎo)活性［5］，抗腫瘤活性［6-7］等.邁克爾反應(yīng)受體分子是一類重要的烷化劑，它能與細(xì)胞酶中半胱氨酸殘基的巰基或細(xì)胞上其他親核基團(tuán)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成共價鍵結(jié)合，從而產(chǎn)生重要的生物效應(yīng)［2，7-8］.冬凌草甲素和冬凌草乙素是從中藥冬凌草（Rabdosia rubescens）中分離出來的具有抗腫瘤等活性的對映貝殼杉烯二萜類成分［9］，也是一類重要的天然邁克爾反應(yīng)受體分子.對映貝殼杉烯二萜具有較廣譜的抗腫瘤活性，對人早幼粒白血病細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人食管癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞［7，10-11］等許多腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用.研究表明，絕大多數(shù)對映貝殼杉烯類化合物的抗腫瘤活性與其D環(huán)中具有exo-亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)有關(guān).該結(jié)構(gòu)可以與受體氨基酸的親核基團(tuán)，如氨基、羥基及巰基等發(fā)生不可逆邁克爾加成反應(yīng)，從而顯示出較好的抗腫瘤活性，此機(jī)制已得到大多數(shù)研究者的認(rèn)可［12］.還原型谷胱苷肽（GSH）是一種含有游離巰基的生物活性分子，在機(jī)體細(xì)胞中含量豐富.GSH具有很好的清除氧自由基活性，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害的能力［13-14］.GSH的缺乏可引起機(jī)體細(xì)胞受損凋亡，GSH水平是反映機(jī)體細(xì)胞是否健康的標(biāo)志［15-16］.邁克爾反應(yīng)受體分子能與細(xì)胞酶中半胱氨酸殘基的巰基等親核基團(tuán)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成共價鍵結(jié)合，從而產(chǎn)生抗腫瘤等重要的生物效應(yīng).為闡明冬凌草甲素和冬凌草乙素等対映貝殼杉烯二萜抗腫瘤作用機(jī)制，本文作者首次采用紫外光譜動力學(xué)方法測定了冬凌草甲素和冬凌草乙素與谷胱苷肽的邁克爾加成反應(yīng)級數(shù)、速率常數(shù)和平衡常數(shù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

SHIMADZU UV 2550型紫外可見分光光度計（日本島津公司）.冬凌草甲素（≥98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司），冬凌草乙素（≥98%，河南濟(jì)源濟(jì)世藥業(yè)有限公司），還原型谷胱甘肽（GSH，≥98%，阿拉丁試劑（上海）有限公司）.

1.2 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH邁克爾加成反應(yīng)貯備溶液的配制

稱取KH2PO41.36g溶于30.4mL 0.1mol/L NaOH溶液中，加蒸餾水至200mL得pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液.取pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液和甲醇等體積混勻得pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇（1∶1，V∶V）溶液.精確稱取冬凌草甲素13.10mg、冬凌草乙素13.03mg和谷胱甘肽11.06mg，分別置于25mL容量瓶內(nèi)，用pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇（1∶1）溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1.44×10-3mol/L冬凌草甲素、冬凌草乙素和谷胱甘肽反應(yīng)貯備溶液.

1.3 冬凌草甲素（或冬凌草乙素）吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取1mL 1.44×10-3mol/L冬凌草甲素（或冬凌草乙素）反應(yīng)貯備溶液六份分別置于50mL刻度試管中，分別加入50、75、100、125、200和375μL冰醋酸，搖勻，再分別加入1mL 1.44×10-3mol/L谷胱甘肽反應(yīng)貯備溶液，用pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇溶液分別稀釋至4、6、8、10、16和30mL，搖勻，得3.60×10-4、2.40×10-4、1.80×10-4、1.44×10-4、9.00×10-5、4.80×10-5mol/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.以等體積pH＝6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇溶液代替冬凌草甲素（或冬凌草乙素）反應(yīng)貯備溶液，同標(biāo)準(zhǔn)溶液制備方法制備系列空白溶液.以空白溶液為參比，立即在240nm波長處測定吸光度，繪制冬凌草甲素（或冬凌草乙素）的吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線（A-c）.前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在待測反應(yīng)體系中加入冰醋酸作為反應(yīng)終止劑后，冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH邁克爾加成反應(yīng)非常緩慢，可以忽略不計.

1.4 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)紫外光譜動力學(xué)研究

控制反應(yīng)溫度為25℃，于10mL試管中加入冬凌草甲素（或冬凌草乙素）和GSH反應(yīng)貯備溶液各2 mL，混勻，得初始濃度為0.72μmol/L冬凌草甲素（或冬凌草乙素）反應(yīng)液.以240nm為檢測波長，立即進(jìn)行紫外動力學(xué)測定，記錄吸光度隨反應(yīng)時間變化的曲線（A-t），至吸光度不再變化.冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH邁克爾加成反應(yīng)方程式見圖1.

2 結(jié)果與討論

2.1 冬凌草甲素（或冬凌草乙素）吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用紫外分光光度法分別建立了冬凌草甲素和冬凌草乙素的吸光度-濃度（A-c）標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：冬凌草甲素A＝8.010 1c-0.006 6（c：μmol/L），相關(guān)系數(shù)R＝0.999 6，線性范圍為0.048～0.360 μmol/L；冬凌草乙素A＝5.280 4c＋0.030 9，相關(guān)系數(shù)R＝0.999 5，線性范圍為0.048～0.360μmol/L.

2.2 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)紫外光譜動力學(xué)研究

采用紫外光譜動力學(xué)法測定了冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì).加成反應(yīng)吸光度隨反應(yīng)時間變化如圖2所示.從圖2可以看出，隨著反應(yīng)時間的增加，反應(yīng)體系的吸光度均逐漸下降，吸光度下降快慢速度順序?yàn)椋憾璨菁姿兀径璨菀宜?，說明冬凌草甲素反應(yīng)速度比冬凌草乙素快.根據(jù)冬凌草甲素（或冬凌草乙素）吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算吸光度對應(yīng)濃度值，并以濃度倒數(shù)對反應(yīng)時間作圖（圖3）.從圖3可以看出，在反應(yīng)時間0～600s內(nèi)，反應(yīng)物濃度倒數(shù)與反應(yīng)時間基本呈線性關(guān)系，線性回歸方程為：冬凌草甲素1/c＝16.196 0t＋3 917.8（c：mol/L，t：s），相關(guān)系數(shù)R＝0.997 7；冬凌草乙素1/c＝7.480 5t＋3 148.7，相關(guān)系數(shù)R＝0.995 2.說明在反應(yīng)初始階段，冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)符合二級動力學(xué)方程，速率常數(shù)分別為16.196 0L·（mol·s）-1（冬凌草甲素）和7.480 5L·（mol·s）-1（冬凌草乙素）.冬凌草甲素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)速率比冬凌草乙素快一倍以上.這可能是因?yàn)槎璨菀宜氐?4位羥基在變成縮醛后，破壞了原羥基與15位羰基形成的分子內(nèi)氫鍵，降低了雙鍵的親電性導(dǎo)致邁克爾加成反應(yīng)活性下降所致.

圖1 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)方程式Fig.1 The reaction scheme of oridonin and ponicidin with glutathione

圖2 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)吸光度隨反應(yīng)時間變化曲線Fig.2 Plots of the absorbance of oridonin and ponicidin versus reaction time

圖3 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)濃度倒數(shù)隨反應(yīng)時間變化曲線Fig.3 Plots of the reciprocal of concentration of oridonin and ponicidin versus reaction time

2.3 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)平衡常數(shù)測定

冬凌草甲素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)接近30min后反應(yīng)體系吸光度基本不變（約為0.41），說明反應(yīng)已趨于平衡.而冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)接近55min后反應(yīng)體系吸光度才基本不變（約為0.42），說明這時反應(yīng)已趨于平衡.根據(jù)反應(yīng)物初始濃度、反應(yīng)體系平衡時吸光度值以及吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線求得平衡轉(zhuǎn)化率α為92.78%（冬凌草甲素）和89.76%（冬凌草乙素），并由平衡常數(shù)計算公式K＝α/（1-α）2求得25℃條件下，冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)的平衡常數(shù)分別為177.98L/mol和85.60L/mol.說明冬凌草甲素加成反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率比冬凌草乙素高，反應(yīng)更徹底.

3 結(jié)論

冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)符合二級動力學(xué)方程，綜合邁克爾加成反應(yīng)速率、平衡轉(zhuǎn)化率和平衡常數(shù)測定結(jié)果，冬凌草甲素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)活性比冬凌草乙素高得多.根據(jù)反應(yīng)活性，本文作者推測冬凌草甲素的抗腫瘤活性可能比冬凌草乙素更好，這與文獻(xiàn)［6］報道的冬凌草甲素比冬凌草乙素具有更好抗腫瘤活性相一致.

［1］MICHAEL A.Ueber die addition von natriumacetessigund natriummalons?ure?thern zu den aethern unges?ttigter s?uren［J］.J Prakt Chem，1887，35：349-356.

［2］STEERT K，EL-SAYED I，VAN DER VEKEN P，et al.Dipeptidylα-fluorovinyl Michael acceptors：Synthesis and activity against cysteine proteases［J］.Bioorg Med Chem Lett，2007，17：6563-6566.

［3］EKICI O D，LI Z Z，POWERS J C，et al.Design，synthesis，and evaluation of aza-peptide Michael acceptors as selective and potent inhibitors of caspases-2，-3，-6，-7，-8，-9，and-10［J］.J Med Chem，2006，49：5728-5748.

［4］ANAND P，SUNG B，KUNNUMAKKARA A B，et al.Suppression of pro-inflammatory and proliferative pathways by diferuloylmethane（curcumin）and its analogues dibenzoylmethane，dibenzoylpropane，and dibenzyl ideneacetone：Role of Michael acceptors and Michael donors［J］.Biochem Pharmacol，2011，82：1901-1909.

［5］張瀟雨.天然邁克爾反應(yīng)受體分子的快速發(fā)現(xiàn)及活性研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2011.

［6］左海軍，李 丹，吳 斌，等.冬凌草的化學(xué)成分及其抗腫瘤活性［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2005，22（4）：258-262.

［7］李金華，梁念慈，莫麗兒，等.半邊旗5種成分體外細(xì)胞毒活性比較及構(gòu)效關(guān)系分析［J］.藥學(xué)學(xué)報，1998，33（9）641-644.

［8］KUNAKBAEVA Z，CARRASCO R，ROZAS I，et al.An approximation to the mechanism of inhibition of cystein proteases：nucleophilic sulphur addition to Michael acceptors type compounds［J］.J Mol Struct（Theochem），2003，626：209-216.

［9］余祖胤.對映貝殼杉烷類二萜化合物抗腫瘤作用及其分子機(jī)制研究［D］.北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2007.

［10］王 筠，劉清蕓，華海嬰，等.冬凌草甲素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡［J］.中國藥理學(xué)通報，2001，17（4）：402-404.

［11］王 瀚，丁 蘭，劉國安，等.擬缺香茶菜二萜成分及細(xì)胞毒活性研究［J］.西北師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，41（6）：54-57.

［12］FUJITA E，NAGAO Y，KOHNO T，et al.Antitum or activity of acylated oridonin［J］.Chem Pharm Bull，1981，29（11）：3208-3213.

［13］胡俊斌，劉新月，陳燕，等.谷胱苷肽對化療藥物性肝損害的防治作用［J］.中國新藥與臨床雜志，1998，17（4）：231-232.

［14］宋秀麗，楊道峰，田德英.谷胱苷肽對病毒性肝炎病人超氧化物的歧化酶過氧化脂質(zhì)水平的影響及療效［J］.中國新藥與臨床雜志，1998，17（4）：234-235.

［15］MEISTER A.Glutathione-ascorbic acid antioxidant system in animals［J］.J Biol Chem，1994，269：9397-9400.

［16］ARMSTRONG J S，JONES D P.Glutathione depletion enforces the mitochondrial permeability transition and causes cell death in Bcl-2overexpressing HL60cells［J］.FASEB J，2002，16（10）：1263-1265.