范成河，王雪晶，楚廣磊，馬耀華，荊 婧，滕軍放

(鄭州大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 河南 鄭州 450052)

過表達(dá)GBA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬和降低α-synuclein的表達(dá)

范成河，王雪晶，楚廣磊，馬耀華，荊 婧，滕軍放*

(鄭州大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 河南 鄭州 450052)

目的探討葡萄糖腦苷脂酶(GBA)對SH-SY5Y細(xì)胞自噬及α-突觸核蛋白(α-synuclein)表達(dá)水平的影響。方法將EGFP-N1、EGFP-GBA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，Western blot檢測Beclin 1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及α-synuclein蛋白的表達(dá)，熒光顯微鏡觀察自噬泡的形成及LC3與GBA在細(xì)胞內(nèi)的共定位。結(jié)果與轉(zhuǎn)染EGFP-N1組相比，轉(zhuǎn)染EGFP-GBA組上調(diào)Beclin 1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 蛋白的表達(dá)水平(Plt;0.05)，而α-synuclein表達(dá)水平則下降(Plt;0.05)；與轉(zhuǎn)染EGFP-N1組相比，轉(zhuǎn)染EGFP-GBA組自噬空泡數(shù)目明顯增加，外源性LC3免疫熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)，且GBA與LC3存在共定位。結(jié)論GBA上調(diào)自噬水平，降低α-synuclein蛋白的表達(dá)。

葡萄糖腦苷脂酶；α-突觸核蛋白；自噬

大量病理的、遺傳的及臨床的研究都證實(shí)葡萄糖腦苷脂酶基因(glucocerebrosidase gene, GBA)基因突變是帕金森病及相關(guān)疾病的重要危險因素[1]。帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的病理標(biāo)志是黑質(zhì)致密部選擇性多巴胺神經(jīng)元的丟失及殘存的神經(jīng)元內(nèi)蛋白聚集體的形成，而α-突觸核蛋白是這些蛋白聚集體的主要組成部分，PD的發(fā)生、發(fā)展以及受累腦區(qū)的變性均與α-突觸核蛋白的異常聚集有密切的聯(lián)系[2-3]。GBA基因的突變可促進(jìn)α-突觸核蛋白相互聚集并形成穩(wěn)定的寡聚體，積聚的α-突觸核蛋白影響了GBA蛋白的活性，而GBA活性的改變反過來又影響了α-突觸核蛋白的清除，由此可見α-突觸核蛋白與GBA蛋白的缺乏在PD的發(fā)病中起到了一個雙向環(huán)路的作用[4]。自噬-溶酶體途徑在清除異常聚集的α-突觸核蛋白中發(fā)揮著重要作用[5]，GBA是溶酶體內(nèi)的一種酶，且GBA與α-突觸核蛋白可相互影響，因此有學(xué)者推測GBA蛋白在自噬-溶酶體和調(diào)控α-突觸核蛋白的表達(dá)中發(fā)揮著某種作用。為此，設(shè)計本實(shí)驗以探討GBA對自噬的調(diào)控及對α-突觸核蛋白表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞及試劑：質(zhì)粒EGFP-N1、EGFP-GBA和RFP-LC3(蘇州大學(xué)藥學(xué)院王光輝教授饋贈)，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院唐北沙教授饋贈)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司)，抗LC3抗體(Abcam公司)、抗GAPDH抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)、抗Beclin抗體(Eptimics公司)，過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Promega公司)，Lipofectamine2000、單丹磺酰尸胺(monodan-sylcadaverine,MDC)和Hochest33258(Sigma公司)，LysoTracker(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：SH-SY5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)15%新鮮胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞以4×108個/L接種于6孔板里，次日轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染具體操作步驟參考脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。

1.2.2 MDC染色：MDC是一種化學(xué)熒光染料，可以標(biāo)記自噬空泡，通過其染色可觀察判斷細(xì)胞自噬的發(fā)生。SH-SY5Y細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染EGFP-N1、EGFP-GBA 24 h后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛室溫固定10 min，磷酸鹽緩沖液(1×PBS)洗3次，加入終濃度為0.05 mmol/L的MDC染色液，37 ℃孵育1 h后加入1×PBS洗3遍，在熒光倒置顯微鏡(Olympus 1×70)下觀察熒光情況，并在400倍視野下，各組細(xì)胞隨機(jī)抽取20個不相重復(fù)的視野進(jìn)行觀察拍照。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)：將SH-SY5Y細(xì)胞按1∶4接種比例接種至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)染后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，1×PBS洗2遍，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛，室溫下固定10 min，1×PBS洗3遍，0.25%聚乙二醇辛基苯基醚(Trito X-100)封閉10 min，1×PBS洗3遍，Hochest33258(1∶10 000)染細(xì)胞質(zhì)，室溫下避光孵育3 min，1×PBS洗3次，用熒光倒置顯微鏡觀察并分析熒光情況(568 nm激發(fā)，探測RFP紅色熒光；488 nm激發(fā)，探測EGFP綠色熒光)，并在400倍視野下，各組細(xì)胞隨機(jī)抽取20個不相重復(fù)的視野觀察和拍照。

1.2.4 蛋白印跡(Western blot)：SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞提取總蛋白制成所需樣品；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗3次，加入抗Beclin1(1∶800)、抗α-synuclein(1∶1 000)、抗LC3(1∶300)抗體，4 ℃過夜。次日加入HRP結(jié)合的二抗(山羊抗兔IgG,1∶5 000)，室溫孵育2 h后行ECL光化學(xué)法顯色，暗室下行X線膠片曝光，內(nèi)參為GAPDH。各組Western blot蛋白條帶用AlphaEaseFC(FluorChem8900)軟件分析圖像，采用平均吸光度值比較各組蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1Westernblot檢測細(xì)胞內(nèi)源性Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、α-synuclein的表達(dá)

與轉(zhuǎn)染EGFP-N1組相比，轉(zhuǎn)染EGFP-GBA組內(nèi)源性Beclin 1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(Plt;0.05)，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高(Plt;0.05)，而α-synuclein表達(dá)減少(Plt;0.05)(圖1，表1)。

圖1 過表達(dá)GBA后對α-synuclein、Beclin1和LC3蛋白的影響Fig 1 The influence of GBA overexpression on α-syn- uclein, Beclin1 and LC3 protein expression

表1 GBA對α-synuclein、Beclin 1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響Table 1 Effect of GBA on protein of α-synuclein, Beclin 1 and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ

*Plt;0.05 compared with EGFP group.

2.2 免疫熒光觀察MDC和Lysotracker染色

與轉(zhuǎn)染HA組相比，轉(zhuǎn)染HA-GBA組MDC染色信號增強(qiáng)，自噬空泡聚集增多(圖2A)。同時利用溶酶體標(biāo)志物L(fēng)ysoTracker Red DND-99來觀察溶酶體熒光強(qiáng)度的變化(圖2B)。

2.3轉(zhuǎn)染后觀察細(xì)胞內(nèi)RFP-LC3和EGFP-GBA的免疫熒光信號及共定位

與轉(zhuǎn)染EGFP組相比，轉(zhuǎn)染EGFP-GBA組RFP-LC3的免疫熒光信號明顯增強(qiáng)，外源性LC3的表達(dá)明顯上調(diào)，自噬水平上調(diào)；且RFP-LC3和EGFP-GBA存在亞細(xì)胞共定位(圖3)。

3 討論

研究證實(shí)GBA基因是PD重要的危險因素，其與PD發(fā)病機(jī)制的關(guān)系主要有兩種假設(shè)：一種是GBA基因突變導(dǎo)致蛋白錯誤折疊，抑制了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的活性，導(dǎo)致異常蛋白的降解減少[6]；另一種是GBA基因突變導(dǎo)致GBA在體內(nèi)聚集，引起自噬障礙或溶酶體機(jī)能不全，使α-突觸核蛋白的聚集增多[7]。GBA蛋白與α-突觸核蛋白在體內(nèi)外都存在相互作用，且二者共定位在組織蛋白酶D陽性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)[8]。在一種GBA基因突變的鼠模型的海馬區(qū)域中發(fā)現(xiàn)，GBA基因的突變和下調(diào)GBA的表達(dá)都能上調(diào)α-突觸核蛋白的表達(dá)[9]；在本實(shí)驗中，過表達(dá)GBA使α-突觸核蛋白的表達(dá)水平明顯降低，這與GBA基因突變導(dǎo)致GBA缺乏引起α-突觸核蛋白聚集、濃度增加的結(jié)果相對應(yīng)。

越來越多的研究證實(shí)，自噬調(diào)節(jié)途徑的病理改變可能是易聚集蛋白(如α-突觸核蛋白)在受損神經(jīng)元內(nèi)積聚的主要原因，與PD等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯增高[12-13]，Beclin1表達(dá)明顯上調(diào)[14]。在一個過表達(dá)GBA基因突變(D409V)的動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，GBA基因的突變導(dǎo)致α-突觸核蛋白的聚集， 但這種聚集可被自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素逆轉(zhuǎn)[9]。 在該實(shí)驗中，過表達(dá)GBA使Beclin1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高，且MDC染色結(jié)果也顯示細(xì)胞內(nèi)自噬空泡數(shù)目明顯增加，溶酶體標(biāo)志物也顯示溶酶體的數(shù)量明顯增加。共轉(zhuǎn)染HA-GBA和RFP-LC3，LC3熒光強(qiáng)度增加，且HA-GBA和RFP-LC3存在明顯的共定位，由此表明過表達(dá)GBA可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。

A.in GBA overexpressing groups,the bright green dots of MDC staining were increased in the morphologic picture, which marked autophagy; B.immunofluorescene showed that the bright red dots of Lysotracker staining were increased in GBA overexpressing groups

圖2共聚焦倒置顯微鏡觀察MDC和Lysotracker染色情況
Fig2ConfocalfluorescencemicroscopyimageofMDCandLysotrackerstaining(×400)

Immunoflourescence analysis showed that GBA(green) colocalized with LC3(red) in the cytoplasm of SH-SY5Y cells圖3 GBA和LC3在SH-SY5Y細(xì)胞中的共定位關(guān)系Fig 3 Co-localization of GBA and LC3 in SH-SY5Y cells(×400)

過表達(dá)GBA既可以上調(diào)自噬水平，又能使α-突觸核蛋白表達(dá)降低，二者是否存在關(guān)聯(lián)呢？自噬可通過降解那些觸發(fā)早期階段細(xì)胞死亡的損傷的異常蛋白(如α-突觸核蛋白)，從而對神經(jīng)元起保護(hù)作用，而抑制神經(jīng)元內(nèi)的自噬則會導(dǎo)致蛋白聚集體的積聚和神經(jīng)元的變性。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GBA可以誘導(dǎo)自噬，自噬又是降解α-突觸核蛋白的重要途徑，且GBA與α-突觸核蛋白共定位在組織蛋白酶D陽性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)[8]，由此推測過表達(dá)的GBA可能部分通過自噬降低α-突觸核蛋白的表達(dá)水平，但該推測及具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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Overexpression of GBA induces autophagy and decreases α-synuclein expression in SH-SY5Y cells

FAN Cheng-he, WANG Xue-jing, CHU Guang-lei, MA Yao-hua, JING Jing, TENG Jun-fang*

(Dept. of Neurology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of autophagy induced by GBA and the regulation of GBA on the expression of α-synuclein in SH-SY5Y cells.MethodsThe recombinated plamid EGFP-N1, EGFP-GBA were transfected into SH-SY5Y cells through eukaryotic cell transfection technique. The expression of beclin1, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and α-synuclein in the level of protein was detected through Western blot，MDC staining and cellular immunofluorescence microscopy were performed to observe the change of autophagic vacuolization and their subcellular colocalization.ResultsCompared to EGFP-N1 group, the expression of Beclin1 and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in group of overexpression EGFP-GBA were significantly increased, and the average number of autophagic vacuoles per cell increased, however, the expression of α-synuclein was significantly decreased (Plt;0.05). Besides, the signals for LC3, GBA and the extent of their co-localization increased in GBA groups.ConclusionsGBA protein decreases the expression of α-synuclein and induces autophagy of SH-SY5Y cells.

GBA; α-synuclein; autophagy

2013-07-18

2013-10-28

國家自然科學(xué)基金(81241046)

*通信作者(correspondingauthor)： 13838210077@163.com

1001-6325(2014)04-0480-05

研究論文

R 741.02

A