李文賢，林曉杰，于 磊，劉海蕾，陳 強*

(青島大學 醫(yī)學院 附屬醫(yī)院 1.泌尿外科； 2.兒內(nèi)科，山東 青島 266003；3.青島市第八人民醫(yī)院 泌尿外科， 山東 青島 266100； 4.潞安集團 總醫(yī)院 泌尿外科， 山西 長治 046204)

腎透明細胞癌中CXCR4和MMP-2表達增強

李文賢1，林曉杰2，于 磊3，劉海蕾4，陳 強1*

(青島大學 醫(yī)學院 附屬醫(yī)院 1.泌尿外科； 2.兒內(nèi)科，山東 青島 266003；3.青島市第八人民醫(yī)院 泌尿外科， 山東 青島 266100； 4.潞安集團 總醫(yī)院 泌尿外科， 山西 長治 046204)

目的研究腎透明細胞癌(ccRCC)組織中CXC趨化因子受體4(CXCR4)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達及意義。方法用免疫組織化學PV6000和RT-PCR法聯(lián)合檢測88例ccRCC組織和48例正常腎組織中CXCR4和MMP-2蛋白及mRNA的表達。結(jié)果在ccRCC組織中CXCR4和MMP-2蛋白及mRNA的表達顯著高于正常腎組織(Plt;0.05)；在ccRCC組織中CXCR4和MMP-2蛋白及mRNA的表達與腫瘤的臨床分期、病理分級及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(Plt;0.05)，而與患者年齡、性別及腫瘤直徑無關(guān)；在ccRCC組織中CXCR4和MMP-2的表達在蛋白水平及基因水平均呈正相關(guān)(Plt;0.05)。結(jié)論CXCR4和MMP-2可能在ccRCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮協(xié)同作用，有望為ccRCC診治提供新途徑。

腎透明細胞癌；CXC趨化因子受體4；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；免疫組織化學；RT-PCR

腎細胞癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是腎癌中最常見的病理類型，約占腎癌患者的70%～80%[1]?；颊咴缙诎Y狀往往不明顯，發(fā)現(xiàn)時約20%～30%已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[2]。目前腎癌的治療以手術(shù)為主，雖然取得一定的臨床效果，但轉(zhuǎn)移性腎癌預(yù)后極差，5年生存率不到10%[3]。侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者療效和預(yù)后的主要因素，因此選擇較為敏感的檢測腎癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子生物學指標對腎癌患者進行早期診斷、病情評估乃至靶向治療至關(guān)重要。本研究探討CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4, CXCR4)和MMP-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)在ccRCC組織及正常腎組織中表達的相關(guān)性及與臨床病理因素的關(guān)系，為ccRCC的早期診斷和病情評估提供臨床參考價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準及受試者知情同意，收集青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科2012年7月至2013年5月手術(shù)切除的ccRCC標本。其中ccRCC組織標本88例，男63例，女25例，年齡30～79歲，平均(55.7±4.9)歲，腫瘤直徑2.1～12.5 cm，平均5.2 cm。88例ccRCC標本中，根據(jù)2009年美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)的TNM分期，Ⅰ期36例，Ⅱ期29例，Ⅲ期18例，Ⅳ期5例，根據(jù)1997年WHO推薦的組織學分級，高分化41例，中分化30例，低分化(未分化)17例，20例經(jīng)病理證實發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。正常腎組織標本48例，取自距腫瘤切緣5 cm以上的正常腎組織，作為正常對照。上述標本均經(jīng)病理檢查確診，所有患者術(shù)前均未行放療、化療或栓塞治療。所有標本離體后迅速分成兩份，一份立即投入液氮中凍存，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存；另一份經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋保存。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑：鼠抗人CXCR4單克隆抗體(Ramp;D公司)，鼠抗人MMP-2單克隆抗體和PV6000試劑盒(北京中杉金橋公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.2 免疫組化PV6000法檢測組織中蛋白的表達：具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師雙盲獨立閱片得出。CXCR4和MMP-2陽性表達主要分布于細胞膜和(或)細胞質(zhì)，呈棕黃或棕褐色顆粒狀。根據(jù)陽性細胞率和染色強度進行評分:1)陽性細胞率:隨機選取10個高倍視野進行記數(shù),每個視野讀取200個細胞，計算陽性細胞率,并取平均數(shù)。陽性率lt;5%為0分,5%～10%為1分,10%～50%為2分,gt;50%為3分。2)染色強度:無著色者為0分,輕度著色(淺黃色)為1分,中度著色(棕黃色)為2分,重度著色(棕褐色)為3分。免疫組化結(jié)果由1)+2)得出：0～2分為陰性，3～6分為陽性[4]。

1.2.3 RT-PCR法檢測組織中mRNA的表達：用Trizol試劑提取組織總RNA，嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，獲取的cDNA進行PCR擴增，同時擴增GAPDH作為內(nèi)參照。應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計引物，CXCR4：正義鏈5′-GCCTTATCCTGCCTGGT ATTGTC-3′，反義鏈5′-GCGAAGAAAGCCAGGATGA GGAT-3′，產(chǎn)物長度130 bp；MMP-2：正義鏈5′-AA CTACGATGATGACCGCAAG-3′，反義鏈5′-GACAGA CGGAAGTTCTTGGTG-3′，產(chǎn)物長度164 bp；GAPDH：正義鏈5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′；反義鏈5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，產(chǎn)物長度146 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)測定各電泳條帶吸光度值，計算各目的基因相對表達量(目的基因相對表達量=目的基因條帶吸光度值/GAPDH基因條帶吸光度值)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1 CXCR4和MMP-2蛋白在ccRCC組織和正常腎組織中的表達：在88例ccRCC組織中，有67例(76.1%)CXCR4陽性表達，62例(70.5%)MMP-2陽性表達，而在48例正常腎組織中，有12例(25.0%)CXCR4陽性表達，9例(18.8%)MMP-2陽性表達，CXCR4和MMP-2蛋白在ccRCC組織中表達的陽性率顯著高于正常腎組織(Plt;0.05)(圖1)。

圖1 CXCR4(A)和MMP-2(B)蛋白在ccRCC組織中的表達Fig 1 Expression of CXCR4(A) and MMP-2(B) protein in ccRCC tissues(×200)

2.1.2 CXCR4和MMP-2蛋白的表達與ccRCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系：CXCR4和MMP-2蛋白表達與ccRCC的TNM臨床分期、病理分級及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(Plt;0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤直徑無關(guān)(表1)。

2.1.3 ccRCC組織中CXCR4和MMP-2蛋白表達的相關(guān)性分析：88例ccRCC組織中，CXCR4和MMP-2蛋白同時表達陽性者55例(62.5%)，同時表達陰性者14例(15.9%)。在ccRCC組織中CXCR4和MMP-2蛋白的表達呈顯著正相關(guān)(Plt;0.05)。

2.2 RT-PCR結(jié)果

2.2.1CXCR4和MMP-2 mRNA在ccRCC和正常腎組織中的表達：CXCR4和MMP-2 mRNA在ccRCC組織中的表達分別為(0.688±0.316)和(0.621±0.300)，顯著高于正常腎組織中的(0.377±0.149)和(0.347±0.139)(Plt;0.05)(圖2)。

表1 ccRCC組織中CXCR4和MMP-2 蛋白的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 Correlation of MMP-2 and CXCR4 proteinexpression with clinicopathological parameters (%, n=88)

*Plt;0.05 compared with well and moderately differentiated；#Plt;0.05 compared with stage Ⅰ and Ⅱ；△Plt;0.05 compared with positive results of lymph node metastasis.

M.marker；1，1′.expression of mRNA in normal tissue and tumor tissue of the same patient；2，2′.expression of mRNA in normal tissue and tumor tissue of the same patient圖2 CXCR4和MMP-2 mRNA在腎透明細胞癌和正常腎組織中的表達Fig 2 Expression of CXCR4 and MMP-2 mRNA in ccRCC and normal renal tissues

2.2.2CXCR4和MMP-2 mRNA的表達與ccRCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系：CXCR4和MMP-2 mRNA的表達與ccRCC的TNM臨床分期、病理分級及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(Plt;0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤直徑無關(guān)(表2，圖3)。

表2 ccRCC組織中CXCR4和MMP-2 mRNA的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Correlation of CXCR4 and MMP-2 mRNAexpression with clinicopathological parameters

*Plt;0.05 compared with well and moderately differentiated；#Plt;0.05 compared with stage I and II；△Plt;0.05 compared with positive results of lymph node metastasis.

M.marker；0.expression of mRNA in normal renal tissues；1～4.expression of mRNA in stage Ⅰ～Ⅳ of ccRCC圖3 CXCR4和MMP-2 mRNA在各分期ccRCC組織中的表達Fig 3 Expression of CXCR4 and MMP-2 mRNA in different clinical stages of ccRCC

2.2.3 ccRCC組織中CXCR4和MMP-2 mRNA表達的相關(guān)性分析：在ccRCC組織中CXCR4和MMP-2 mRNA的表達呈顯著正相關(guān)(Plt;0.05)。

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學特征之一，也是患者治療失敗和死亡的主要原因，該過程由多基因調(diào)控，復(fù)雜而有序，具有高度器官選擇性。

CXCR4及其配體基質(zhì)細胞衍化因子(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)所組成的生物軸在腫瘤細胞的生長、增殖、黏附及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5]，本研究發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白及mRNA在ccRCC組織中高表達，提示其可能參與ccRCC的發(fā)生、生長，可能與CXCR4通過促進腫瘤血管的生成從而間接促進腫瘤的生長有關(guān)。進一步研究分析顯示：CXCR4在腎癌中的表達與腫瘤的臨床分期、病理分級及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示CXCR4與腎癌的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，其分子機制可能是高表達CXCR4的腫瘤細胞在SDF-1的趨化牽引下，逆濃度梯度轉(zhuǎn)移至作為配體產(chǎn)生源的淋巴結(jié)，從而實現(xiàn)特異性轉(zhuǎn)移。國外相關(guān)研究報道，高表達CXCR4的腎癌患者無病生存期短，預(yù)后差[6]，動物實驗發(fā)現(xiàn)應(yīng)用受體拮抗劑CTCE-9908可以阻斷CXCR4的表達，從而抑制乳腺癌小鼠模型原發(fā)腫瘤的生長并降低腫瘤的轉(zhuǎn)移率[7]。因此CXCR4有可能作為一種新的腫瘤標志物和治療靶點，為腎癌患者病情發(fā)展及預(yù)后的評估乃至治療提供新的思路。

細胞外基質(zhì)被認為是腫瘤細胞侵襲過程中的第一道也是最主要的生理屏障，突破細胞外基質(zhì)是腫瘤細胞進行侵襲和轉(zhuǎn)移的必要條件。MMP-2可通過降解細胞外基質(zhì)的主要成分IV型膠原及促進腫瘤血管的生成等作用參與惡性腫瘤的進展[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在ccRCC組織中高表達且與腎癌的臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示MMP-2可能與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，是ccRCC具有較強侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的重要標志。

目前國內(nèi)外尚無從蛋白及mRNA水平聯(lián)合檢測CXCR4和MMP-2在ccRCC中的表達及協(xié)同作用的相關(guān)報道。本實驗證實在ccRCC組織中CXCR4和MMP-2的表達呈正相關(guān)，雖然二者在腎癌中聯(lián)合表達的機制尚未明了，但我們認為這可能與二者在腎癌中有共同的信號傳導(dǎo)通路有關(guān)，該結(jié)果提示CXCR4和MMP-2可能在ccRCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用。本研究為尋找ccRCC病情評估的生物學指標提供了可靠的實驗依據(jù)，為ccRCC的診治提供重要的臨床價值。

[1] Rini Bl,Campbell SC,Escudier B.Renal cell carcinoma[J],Lancet,2009,373: 1119-1132.

[2] Yoshimura K,Minami T,Nozawa M,etal.Phase I clinical trial of human vascular endothelial growth factor receptor 1 peptide vaccines for patients with metastatic renal cell carcinoma[J].Br J Cancer,2013,108:1260-1266.

[3] Schrader AJ,Varga Z,Hegele A,etal.Second-line strategies for metastatic renal cell carcinoma:classics and novel approaches[J].J Cancer Res Clin Oncol,2006,132: 137-149.

[4] Andre F,Cabioglu N,Assi H,etal.Expression of chemokine receptors predicts the site of metastatic relapse in patients with axillary node positive primary breast cancer[J].Ann Oncol,2006,17:945-951.

[5] 喻松霞,李劍.CXCL12-CXCR4/CXCR7軸信號傳導(dǎo)通路與腫瘤細胞生物學特性的關(guān)系[J].基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床,2012,32:349-353.

[6] D’Alterio C,Consales C,Polimeno M,etal.Concomitant CXCR4 and CXCR7 expression predicts poor prognosis in renal cancer[J].Curr Cancer Drug Targets,2010, 10:772-781.

[7] Huang EH,Singh B,Cristofanilli M,etal.A CXCR4 antagonist CTCE-9908 inhibits primary tumor growth and metastasis of breast cancer[J].J Surg Res,2009, 155:231-236.

[8] 王華陽,董召剛,程歡歡,等.KIF1B在瘦素促進妊娠早期絨毛滋養(yǎng)細胞MMP-2表達中的作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床,2013,33:139-143.

[9] Egeblad M,Werb Z.New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression[J]. Nat Rev Cancer,2002,2:161-174.

Increased expression of CXCR4 and MMP-2 in clear cell renal cell carcinoma

LI Wen-xian1, LIN Xiao-jie2, YU Lei3, LIU Hai-lei4, CHEN Qiang1*

(1.Dept. of Urology; 2.Dept. of Pediatrics, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003;3.Dept. of Urology, Qingdao Eighth People’s Hospital, Qingdao 266100; 4.Dept. of Urology,Lu’an Group General Hospital, Changzhi 046204, China)

ObjectiveTo study the expression and significance of CXC chemokine receptor 4(CXCR4)and matrix metalloproteinases-2(MMP-2)in clear cell renal cell carcinoma(ccRCC)tissues.MethodsThe expression of CXCR4 and MMP-2 mRNA in 88 cases of fresh ccRCC tissues and 48 cases of normal renal tissues were detected by RT-PCR. Meanwhile, the expression of CXCR4 and MMP-2 protein was examined by immunohistochemical PV6000 assay.ResultsThe expression of CXCR4 and MMP-2 mRNA and protein in ccRCC tissues were significantly higher than those in normal ones(Plt;0.05). Furthermore, the expression of CXCR4 and MMP-2 in ccRCC tissues had a significant relationship with clinical stage, pathological grade and lymph node metastasis(Plt;0.05), while not with gender and age of patients and the diameter of tumors. Moreover, there was a positive correlation between the expression of CXCR4 and MMP-2 in ccRCC tissues (Plt;0.05).ConclusionsCXCR4 and MMP-2 may have a synergistic effect on the process of occurrence,development, invasion and metastasis of ccRCC, and thus provide a novel strategy for diagnosis and therapy of ccRCC.

clear cell renal cell carcinoma; CXCR4; MMP-2; immunohistochemistry; RT-PCR

2013-07-15

2013-10-28

山東省科技發(fā)展計劃(2011YD18009)

*通信作者(correspondingauthor)： qiangqddx@163.com

1001-6325(2014)04-0499-05

研究論文

R 737.11

A