肖厚勤， 費 沛， 陳新河， 胡兆雄，張 永，劉雙信，史 偉*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬太和醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖北 十堰 442000；2.廣東省人民醫(yī)院 腎內(nèi)科， 廣東 廣州 510080)

研究論文

1,25(OH)2D3抑制嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的腎病大鼠TRPC6的表達

肖厚勤1，2*， 費 沛1， 陳新河1， 胡兆雄1，張 永1，劉雙信2，史 偉2*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬太和醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖北 十堰 442000；2.廣東省人民醫(yī)院 腎內(nèi)科， 廣東 廣州 510080)

目的觀察1,25-二羥維生素D3[1,25(OH)2D3]對嘌呤霉素氨基核苷(PAN)腎病大鼠腎臟TRPC6表達的影響。方法大鼠隨機分為對照組(Con)、模型組(Mod)和1,25(OH)2D3治療組(Vit D)，每組n=10。Mod組和Vit D組每10天尾靜脈注射PAN 100 mg/kg建立PAN腎病模型。Vit D組每天給予1,25(OH)2D30.2 μg/kg灌胃。在1和3月時分兩批處死動物，檢測24 h尿蛋白、腎功能、血脂和血漿蛋白；PAS染色和透射電鏡觀察腎組織學(xué)改變；RT-PCR、激光共聚焦檢測TRPC6、synaptopodin及nephrin的表達和分布。結(jié)果PAN腎病大鼠逐漸出現(xiàn)大量蛋白尿、大量腹水、高脂血癥和低蛋白血癥腎病綜合征的表現(xiàn)。病理呈現(xiàn)腎間質(zhì)水腫、炎性細胞浸潤、大量的蛋白管型及局灶節(jié)段性腎小球硬化、腎小管萎縮和纖維化。與Mod組大鼠比較Vit D組大鼠24 h尿蛋白顯著減少[1月時，(338±120)mgvs(669 ±142)mg，3月時(432±83)mgvs(601±95)mg，Plt;0.01]，腎小球硬化指數(shù)顯著減輕[(2.3+0.6)vs(3.4+0.4),Plt;0.01]，腎功能改善[Cr(40.2±3.4)μmol/Lvs(53.4±6.3)μmol/L，BNU(9.4±3.0)mmol/Lvs(17.3±2.9)mmol/L，Plt;0.01]；激光共聚焦顯示PAN大鼠TRPC6 表達顯著升高并與synaptopodin高度融合， Nephrin mRNA的表達顯著降低；與Mod組大鼠比Vit D組大鼠TRPC6 mRNA顯著降低，nephrin的表達顯著升高[在1月時，(0.42±0.10) vs(0.75±0.14)；在3月時(0.35±0.07)vs(0.68±0.10)，Plt;0.01]，Nephrin mRNA[在1月時(0.81±0.19)vs(0.33±0.09)；在3月時(0.77±0.10)vs(0.44±0.10)，Plt;0.01]。結(jié)論1,25(OH)2D3通過抑制PAN腎病大鼠TRPC6的表達來發(fā)揮腎臟保護作用。

足細胞；1,25-二羥維生素D3，嘌呤霉素氨基核苷； TRPC6

早期補充活性維生素D(VitD)具有獨立鈣磷代謝之外的腎臟保護作用，然而其作用機制并不清楚[1-2]。瞬時受體電位離子通道6(transient recep tor potential cation channel 6， TRPC6)屬于TRP大家族成員之一，其突變或活化主要引起瞬時鈣離子內(nèi)流增加。最近的實驗表明[3-4]，抑制足細胞TRPC6的活化可能是治療蛋白尿性腎臟疾病的新靶點，VitD的腎臟保護作用是否與TRPC6離子通道有關(guān)尚不清楚。本實驗建立了嘌呤霉素氨基核苷腎病(puromycin aminonucleoside nephropathy, PAN)大鼠模型，觀察了TRPC6在PNA大鼠腎組織中的表達、定位及VitD對其表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗鼠nephrin多克隆抗體 (Santa Cruza公司),兔抗 TRPC6多克隆抗體(ABCAM公司)，cy3-標記的羊抗兔IgG(Sigma公司)；DEPC、Trizol試劑(invitrogen公司)；RNA酶抑制劑、一步法 RT-PCR試劑盒(南京凱基公司)。引物由上海生物工程公司合成。

1.2 PAN腎病大鼠模型的制備及實驗分組

30只雄性SD大鼠(SPF級，南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，合格證號0025926)，隨機分為正常對照組(Con)、模型組(Mod)和1,25(OH)2D3治療組(Vit D)，每組10只。PAN溶入0.9%氯化鈉注射液中配制成50 mg/mL 4 ℃保存。Mod組和Vit D組每隔10 d尾靜脈注射PAN 100 mg/kg，連續(xù)3次建立足細胞損傷的PAN動物模型，Con組給予等量的0.9%氯化鈉注射液。Vit D組于造模前兩天每天給予1,25(OH)2D30.2 μg/kg灌胃，正常對照和模型組每天給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃。于1月和3月時分兩批處死動物，每次5只，分別檢測不同時間點24 h尿蛋白、腎功能、血脂和血漿蛋白； 大鼠以10%水合氯醛麻醉后無菌手術(shù)打開腹腔，心臟取血留血標本進行生化檢測，留取雙側(cè)腎臟，腎組織分四部分，分別經(jīng)4%的多聚甲醛緩沖液固定、2.5%戊二醛固定、送冰凍切片及皮及髓質(zhì)分離后置于液氮中凍存。

1.3 血及尿樣本的檢測

24 h尿蛋白采用紫外分光光度法(貝克曼庫爾特公司)，采用BT-224型自動生化分析儀檢測各組大鼠電解質(zhì)和腎功能。

1.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察

腎組織標本經(jīng)常規(guī)固定、包埋及切片行HE、PAS染色。另一部分用2.5%戊二醛固定制成超薄切片透射電鏡觀察。腎小球硬化指數(shù)的判定為：每例標本在高倍視野下隨機選取25個腎小球，根據(jù)每個腎小球硬化的程度和范圍計算積分，0分：無硬化；1分：局灶節(jié)段性硬化lt;25%；2分：25%≤硬化范圍lt;50%；3分：50%≤硬化范圍lt;75%；4分：75%≤硬化范圍。由3人盲法同時進行，得出每例標本的平均積分。

1.5 激光共聚焦

取新鮮大鼠腎組織立即冰凍切片，厚度3 μm，丙酮-20 ℃固定，PBS水洗， 0.5% Triton X-100透化20 min， 5%小牛血清室溫封閉20 min，加一抗(用1%小牛血清稀釋)放在濕盒里，4 ℃過夜或室溫度2 h，1×PBS洗3次，每次5 min，如做雙重免疫熒光，再加第二種一抗(注意和第1個一抗種屬須不同)，加熒光二抗(用1% BSA稀釋)37 ℃ 60 min，閉光，1×PBS洗3次，每次5 min，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 總RNA的提取及RT-PCR

取液氮中凍存的腎皮質(zhì)約100 mg，在碾缽中碾成粉末，用Trizol1試劑標準程序提取腎皮質(zhì)總RAN。取50～100 ng總RNA按南京凱基一步法試劑盒說明配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。各目的基因引物序列分別為：nephrin：上游：5′-AGCCTCTTGACCATCG CTAA-3′；下游：5′-CCCAGTCAGCGTGAAGGTAG-3′；產(chǎn)物302 bp；TRPC6，上游： 5′-GATATCTTCAAATT CATGGTCATA-3′,下游5′-：TCCGCATCATCCTCAAT TTC-3′；內(nèi)參β-actin：上游：5′-CACCCGCGAGTACA ACCTTC-3′；下游：5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′；產(chǎn)物206 bp;PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析成像，以目的基因片斷 /β-actin片斷的條帶吸光度比值進行比較。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白及血生化的改變

與正常大鼠(Con)相比，PAN腎病大鼠精神狀態(tài)差，出現(xiàn)大量腹水，大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥等典型的腎病綜合征的表現(xiàn)。與PAN模型組相比VitD組尿蛋白的分泌顯著減少，血漿蛋白顯著升高，血肌酐水平顯著下降(Plt;0.05)(表1)。

2.2 大鼠腎臟的病理改變

PAN誘導(dǎo)的模型組大鼠在1月時出現(xiàn)腎間質(zhì)水腫，并出現(xiàn)大量的蛋白管型、炎性細胞浸潤并伴有小管間質(zhì)的壞死和萎縮，腎小球硬化尚不明顯；在3月時明顯的出現(xiàn)典型腎小球的節(jié)段局灶性硬化伴有腎間質(zhì)的纖維化，腎小管蛋白管型。VitD組大鼠上述改變明顯減輕，炎性細胞減少，在3月時的腎小球硬化指數(shù)和間質(zhì)纖維化指數(shù)明顯減輕(Plt;0.01)(圖1)。電鏡結(jié)果顯示嘌呤霉素氨基核苷腎病大鼠出現(xiàn)足突廣泛融合、溶酶體壞死，腎間質(zhì)水腫，在3月時足突融合進一步加重，局部出現(xiàn)足突吸收，腎小球硬化?；钚跃S生素D治療大鼠上述改變明顯減輕(圖2)。

表1 不同組大鼠24 h尿蛋白和血生化水平Table 1 24-Hour urinary protein excretion and biochemical parameter levels (n=5)

*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.05,##Plt;0.01 compared with PAN,n=5; Con.control；PAN.PAN model；Vit D.1,25(OH)2D3.

A,B.control; C.PAN model in one month; D.PAN model in three month; E.Vit D rat in one month; F.Vit D rat in three month;*Plt;0.01 compared with control，#Plt;0.01 compared with model； Con，control；Mod，PAN model；Vit D，1,25(OH)2D3

圖1不同組大鼠腎小球硬化指數(shù)的改變
Fig1Indexofglomerularsclerosisamongdifferentgroup(×400)

A.rat of PNA mode in one month; B.rat of 1,25(OH)2D3group in one month; C.rat of PNA mode in three month; D.rat of 1,25(OH)2D3group in three montsh; E.control rat

圖2不同組大鼠腎小球足突超微結(jié)構(gòu)的改變
Fig2FootprocessUltrastructuralofglomcrulusamongdifferentgroupsbytransmissionelectronmicroscope(×6700)

2.3 Nephrin mRNA和免疫熒光的改變

在正常大鼠nephrin mRNA處在較高水平，PAN后顯著降低，VitD組顯著促進了nephrin mRNA的表達(圖3)。免疫熒光顯示正常腎臟大鼠nephrin沿腎小球基底膜線狀排列，PAN后熒光強度明顯減弱，不連續(xù)分布，VitD組處理后nephrin的改變得到部分恢復(fù)。

2.4 TRPC6 mRNA表達的改變

TRPC6在正常大鼠表達微弱，PAN模型在1月時表達最強，分布最廣，而且與足細胞標志蛋白synaptopodin高度融合；PAN模型組在3月時成局灶節(jié)段性改變，與synaptopodin部分融合(圖4)。同樣發(fā)現(xiàn)在正常組大鼠TRPC6 mRNA處在較低水平，PAN注射后顯著升高，VitD組TRPC6mRNA表達顯著降低(圖5)。

3 討論

VitD特別是活性的1α,25(OH)2D3及其類似物在調(diào)節(jié)鈣磷代謝、降低蛋白尿、延緩慢性腎臟病進展等方面具有重要作用。筆者前期的研究也發(fā)現(xiàn)：活性的1α,25(OH)2D3可以抑制嘌呤霉素氨基核苷腎病大鼠足細胞凋亡[5-6]、調(diào)控TGF-β1/BMP-7信號的平衡而發(fā)揮腎臟的保護作用[7]，但1α,25(OH)2D3對腎臟保護的精確機制并不清楚。

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with Control;#Plt;0.01 compared with Model； Con.control；Mod.PNA model；Mod+Vit D.1,25(OH)2D3group

圖31,25(OH)2D3抑制nephrinmRNA表達的下調(diào)
Fig31,25(OH)2D3preventsdownregulationofnephrinexpression

The picture indicated Co-localization of TRPC6(red)and synatopodin (green) in glomerular podocyte in Control rat(top), PNA model one month rat(middle) and PNA model three month rat (bottom)

圖4TRPC6在PAN模型中的表達與定位
Fig4TRPC6expressionandlocationinPANratmodel(×400)

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control; #Plt;0.05, ##Plt;0.01 compared with PAN model；Con.control；Mod.PNA model；Mod+Vit D.1,25(OH)2D3 group圖5 不同組大鼠TRPC6 mRNA表達的改變Fig 5 TRPC6 mRNA expression and the quantitative results of the band densities in different groups

TRPC6屬于瞬時受體電位通道蛋白TRP大家族，是一個含有931個氨基酸的陽離子通道蛋白，尤其對Ca2+有高度選擇性。Winn等在家族性局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulous sclerosis, FSGS) 的家系中確定存在TRPC6的基因突變[8-9]。隨后，在人類非遺傳性蛋白尿性腎臟疾病如FSGS、微小病變性腎病(minimal-change disease，MCD)和膜性腎病(memberanous glomerulornephritis，MN)患者中證實TRPC6表達也顯著增加[10]，說明在獲得性蛋白尿的腎臟疾病中也存在TRPC6的活化。TRPC6屬于受體介導(dǎo)的鈣通道， 其活化主要引起瞬間的Ca2+內(nèi)流增加。細胞內(nèi)Ca2+增加既可以起到第2信史、發(fā)揮必須的細胞生物學(xué)功能，也可以導(dǎo)致足細胞骨架蛋白的過度收縮和細胞凋亡，從而引起足細胞損傷，抑制TRPC6的活化可能是控制蛋白尿性腎臟疾病治療的新靶點[11-13]。

本實驗首次用PAN誘導(dǎo)足細胞損傷大鼠模型觀察到TRPC6在PAN大鼠早期表達顯著升高，且與足細胞標志蛋白synatopodin高度融合，提示TRPC6主要在足細胞上表達。但在PAN大鼠晚期TRPC6的表達呈局灶節(jié)段性改變，說明TRPC6的活化參與了足細胞損傷的過程。但經(jīng)過1,25(OH)2D3處理的PAN大鼠蛋白尿程度顯著降低，腎小球硬化指數(shù)和腎小管間質(zhì)纖維化的指數(shù)顯著改善，足細胞裂孔隔膜分子nephrin的表達增強，同時TRPC6的表達顯著降低，提示1,25(OH)2D3腎臟保護作用與抑制TRPC6的活化有關(guān)。

VitD主要與維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)結(jié)合后發(fā)揮功能。VitD抑制TRPC6的確切機制并不十分清楚。筆者推測：在正常的腎臟中VDR處于較高水平，TRPC6處于較低水平，足細胞VDR和TRPC6相互影響共同調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+平衡。在病理情況下，由于腎臟1α羥化酶不足，活性維生素D合成減少，VDR處于抑制狀態(tài)，對TRPC6的抑制作用減弱，導(dǎo)致TRPC6的過度活化導(dǎo)致足細胞損傷。

活性維生素D還可抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)[14-15]，而后者的激活與TRPC6的表達密切相關(guān)。因此，1,25(OH)2D3對TRPC6的抑制作用可能與抑制了RAS系統(tǒng)間接有關(guān)。

本實驗發(fā)現(xiàn)PAN腎病大鼠足細胞TRPC6的表達顯著升高，VitD可以顯著抑制TRPC6的表達，降低蛋白尿。

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1,25-dihydroxyvitamin D3inhibits TRPC6expression in kidney of nephrosis rat induced by puromycin aminonucleoside

XIAO Hou-qin1，2*, FEI Pei1, CHEN Xin-he1, HU Zhao-xiong1, ZHANG Yong1, LIU Shuang-xin2, SHI Wei2*

(1.Dept. of Nephrology, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000;2.Dept. of Nephrology, Guangdong Provincial Peoples’s Hospital, Guangzhou 510080,China)

ObjectiveTo evaluate Effect 1,25-dihydroxyvitamin D3[1,25(OH)2D3]on TRPC6 expression in kidney of rat model in puromycin aminonucleoside nephropathy(PAN).MethodsThirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: PAN model group (Mon), 1,25(OH)2D3treated group(Vit D) and normal control group (Con). Con and Vit D rat medols were constructed by consecutive three time intravenous injection PAN of 100 mg.kg-1 body weight every ten days and Vit D rats were gavaged 1,25(OH)2D3(0.2 μ g/kg·d). The rats were sacrificed at one and three months respectively after PAN injection. 24-hour urinary protein excretion was determined. Renal Function and blood lipid were determined by an autoanalyzer. The renal tissue morphology was observed with PAS staining by light and electron microscope. The expression of nephrin, TRPC6 mRNA were evaluated by RT-PCR. The protein expression and location of nephrin and TRPC6 were decided by confocal microscope.ResultsPAN administration caused heavy proteinuria, hydroperitoneum, hyperlipoidemia, hypoproteinemia and as well as loss of renal function. Inflammatory cell infiltration, renal interstitial edema, partly renal tubule atrophy, fibrosis and focal segmental gloumerular sclerosis were recorded. 24 h urinary protein[one month, (338±120)mgvs(669±142)mg, three months (432±83)mgvs(601±95) mg,Plt;0.01]; index of gloumeruslocis in three months[(2.3±0.6)vs(3.4±0.4),Plt;0.01]and renal function[Cr(40.2±3.4)μmol/Lvs(53.4±6.3)μmol/L, BUN(9.4±3.0)mmol/Lvs(17.3±2.9)mmol/L,Plt;0.01]were significant lower in Vit D group compared with Mod group, but was not significant difference in blood fat. TRPC6 mRNA expression was increased and nephrin mRNA expression was decreased in PAN rats model. TRPC6 mRNA expression[1 month, (0.42±0.10)vs(0.75±0.14), three months (0.35±0.07)vs(0.68±0.10),Plt;0.01]were significant lower, and nephrin mRNA[one month, (0.81±0.19)vs(0.33±0.09), three months(0.77±0.10)vs(0.44±0.10),Plt;0.01]was significantly higher.ConclusionsTRPC6 mRNA expression increased and Nephrin mRNA expression decreased in PAN rats model. The renoprotective of 1,25(OH)2D3may be partly attributable to TRPC6 suppress.

podocyte; 1,25-dihydroxyvitamin D3; puromycin aminonucleoside; transient recep tor potential cation channel 6

2013-09-17

2013-11-25

湖北省自然科學(xué)基金重大項目(2010CDA037)；湖北省教育廳重點項目(D20102105)； 十堰市太和醫(yī)院博士啟動項目(2010QD02)

*通信作者(correspondingauthor)： xiaohq7301@126.com

1001-6325(2014)05-0667-07

R 334+.1

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