陳 芳 李 熠 王 勇 曹葳蕤 魏 月 吳黎明

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所；2農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室）

引 言

蜂螨是蜜蜂的天敵，也是蜜蜂最為嚴(yán)重的病害。西方蜜蜂幾乎100%感染大蜂螨，且蜂群每年要用藥物防治1～3次，才能保證蜂群正常繁衍。氟胺氰菊酯因其對(duì)蜜蜂低毒而對(duì)蜂螨的極強(qiáng)殺傷力而被常運(yùn)用于螨害的防治中[1]。當(dāng)向蜂巢中噴灑藥物時(shí)，由于蜜蜂的衛(wèi)生行為，大部分的藥物會(huì)因蜜蜂吞咽活動(dòng)進(jìn)入蜜蜂體內(nèi)；此外，氟胺氰菊酯具有揮發(fā)性，蜜蜂在掛有螨片的蜂箱中活動(dòng)，其身體表面會(huì)沾染藥物。由于蜜蜂的高敏感性和短的生命周期，多數(shù)藥物在很短的時(shí)間內(nèi)在蜜蜂體內(nèi)的殘留都將降至一個(gè)很低的水平，但由于氟胺氰菊酯易穩(wěn)定地積累于巢脾中[2，3]，巢脾（或巢礎(chǔ)）的循環(huán)利用使其成為藥物的二次污染源[4]。蜜蜂在蜂箱內(nèi)可自由活動(dòng)，氟胺氰菊酯就很可能粘附在蜂足上到處散布，藥物殘留就轉(zhuǎn)移到了蜂產(chǎn)品中，造成蜂產(chǎn)品的污染[5]，并在蜜蜂體內(nèi)產(chǎn)生蓄積[6]。由于氟胺氰菊酯具有發(fā)育和生殖毒性，其殘留對(duì)消費(fèi)者存在一定的健康風(fēng)險(xiǎn)[7]，歐盟已將其列入了內(nèi)分泌干擾物名單[8]。因此，本研究擬建立一種快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、高效、穩(wěn)健和安全的（QuEch－ERs）蜜蜂體內(nèi)氟胺氰菊酯殘留檢測(cè)方法。通過測(cè)定蜜蜂體內(nèi)氟胺氰菊酯的殘留來監(jiān)測(cè)蜂產(chǎn)品可能的污染情況。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜－電子捕獲檢測(cè)器（美國Agilent公司）；色譜柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm,HP-5或相當(dāng)者）；天平;均質(zhì)器;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;氮吹儀;離心機(jī)；冷凍研磨儀；冰箱；QuEchERs基質(zhì)分散固相萃取管。

氟胺氰菊酯標(biāo)樣（1000 mg/L,1ml;sigma）。正己烷、乙腈均為色譜純（美國 J.T.Baker公司）；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 蜜蜂樣品提取

取5只蜜蜂用液氮冷后迅速在冷凍研磨儀中粉碎，將粉碎后的蜜蜂轉(zhuǎn)移至15 ml QuEchERs基質(zhì)分散管中，用10 ml乙腈/水（v/v）=5:1分次清洗粉碎池，并且將清洗溶液收集至15 ml分散管中。旋轉(zhuǎn)振蕩提取30 min，取出離心管在8000 rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液，上清液氮吹至1 ml，殘?jiān)儆? ml的乙腈提取一次，5000 rpm/min離心后取上清液至上一次濃縮的小管中，氮吹至干后用2 ml正己烷復(fù)溶過濾備用。

1.3 色譜分析

進(jìn)樣口：260℃ 不分流

檢測(cè)器（μECD）：290℃

程序升溫：100℃保留1 min

8℃/min升至230℃，保留5 min

10℃/min升到290℃，保留3.75 min

載氣：高純氮（>99.999%）

流速：1 ml/min

進(jìn)樣體積：1μl

0.1 mg/L的標(biāo)樣經(jīng)氣相色譜分離后色譜圖見圖1。

圖1 氟胺氰菊酯標(biāo)樣圖

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的提取與凈化

蜜蜂樣品是生物樣品，且蜜囊內(nèi)存有粘稠的蜂蜜樣品，普通的冷凍后機(jī)械粉碎效果不佳，因此在液氮迅速冷凍下用冷凍研磨儀進(jìn)行組織搗碎后再進(jìn)行目標(biāo)化合物的提取。為了實(shí)現(xiàn)快速、高效、準(zhǔn)確的樣品前處理，選擇了商品化的QuEchERs基質(zhì)分散管，實(shí)現(xiàn)提取凈化一體完成。根據(jù)藥物及基質(zhì)的性質(zhì)，選擇了PSA、GBC和C-18等3種可能適合的填料進(jìn)行提取凈化，PSA（N-丙基乙二胺）是一種固相吸附劑有比氨基柱更強(qiáng)的離子交換能力。廣泛用于植物農(nóng)殘分析樣品的處理，去除有機(jī)酸、色素和金屬離子；C-18用于吸附樣品中的脂類物質(zhì)，而GCB（石墨化炭黑）去除色素的效果很好。將這3種填料組合后最終選擇的QuEchERs基質(zhì)分散管的內(nèi)容物分別是:①150 mg PSA，45 mg GCB，900 mg無水 MgSO4；②150 mg PSA，150 mg C-18，900 mg無水 MgSO4；③150 mg PSA，900 mg 無水 MgSO4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①號(hào)基質(zhì)分散固相萃取能夠有效地去除色素及其他基質(zhì)干擾，提取溶液澄清透明且色譜圖干凈，但目標(biāo)化合物的回收率略低；②號(hào)基質(zhì)分散固相萃取后的溶液基本無色且透明，且目標(biāo)化合物出峰時(shí)間段沒有基質(zhì)干擾，回收率也符合農(nóng)獸藥殘留分析要求；③號(hào)基質(zhì)分散固相萃取液顏色較深，且色譜圖中雜峰較多，凈化不完全，長(zhǎng)時(shí)間多次進(jìn)樣可能會(huì)造成進(jìn)樣口、柱子及檢測(cè)器的污染。

綜合上述結(jié)果，本研究選擇了②號(hào)基質(zhì)固相分析體系。各種填料回收率比較的結(jié)果見表1。

表1 3種基質(zhì)固相分散填料對(duì)蜜蜂樣品中氟胺氰菊酯的提取效率比較

2.2 方法的線性、準(zhǔn)確性及精密度

為確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性，以 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L等5個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸的相關(guān)系數(shù)為0.9964，說明氟胺氰菊酯在102的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)具有很好的線性，能夠涵蓋日常分析工作中的濃度變化范圍。以空白加標(biāo)樣品中目標(biāo)化合物出峰時(shí)間左右兩側(cè)基線為噪聲，3倍性噪比為檢出限，該方法的檢出限為4.52μg/kg，以10倍性噪比計(jì)算定量限，定量線為15.1μg/kg。另外，采用了不同濃度的加標(biāo)回收來確定方法的準(zhǔn)確性，加標(biāo)濃度為20μg/kg、50μg/kg及100μg/kg，回收率為64.3～107.2%，以同日及隔日加標(biāo)樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來計(jì)算方法的精密度，日內(nèi)偏差為4.3～8.9%，日間為6.7～11.7%，符合農(nóng)獸藥分析要求。具體結(jié)果見表2。

表2 方法的準(zhǔn)確性及精密度

2.3 蜜蜂樣品的測(cè)定

運(yùn)用上述分析方法，我們測(cè)定了掛螨片蜂群中蜜蜂體氟胺氰菊酯殘留情況，共采集7個(gè)蜂群蜜蜂樣品63個(gè)，時(shí)間跨度為掛片當(dāng)天至掛片后65天，施藥濃度為不掛片、半片、1片及2片。結(jié)果顯示，未施藥時(shí)，所有蜂群的蜜蜂樣品中氟胺氰菊酯殘留基本處于檢出限附近，個(gè)別樣品為未檢出；施藥后，在未掛螨片的蜂群中，蜜蜂體內(nèi)的氟胺氰菊酯殘留水平顯著低于施藥蜂群，但其變化規(guī)律與用藥蜂群基本一致，在3～7天達(dá)到峰值，之后迅速下降，13天以后緩慢下降，至45天后殘留水平基本在檢出限附近；不同用藥水平對(duì)蜜蜂體殘留的影響主要體現(xiàn)在殘留峰值上，最大施藥蜂群的殘留峰值可高達(dá)1 mg/kg，在13天后差異不明顯。

圖2 不同用藥水平對(duì)蜜蜂體內(nèi)氟胺氰菊酯殘留的影響

3 結(jié)論

用液氮冷凍研磨，QuEchERs固相基質(zhì)分散提取凈化蜜蜂樣品，是一種快速、高效、準(zhǔn)確的樣品前處理方法，PSA和C-18能有效地去除糖類、脂類及少量色素類物質(zhì)的干擾，達(dá)到有效凈化。該方法具有能涵蓋日常測(cè)定需求的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度。蜜蜂樣品的分析表明，蜜蜂體內(nèi)的氟胺氰菊酯殘留峰值主要集中在施藥后的3～7天，由于藥物的自然揮發(fā)及蜜蜂生命周期短等原因，蜂群中蜜蜂體內(nèi)的氟胺氰菊酯殘留急劇下降，其殘留水平在檢出限附近。

[1]代平禮，王強(qiáng)，孫繼虎，等.4種農(nóng)藥對(duì)意大利蜜蜂的毒力測(cè)定.農(nóng)藥,2007（08）:546-547.

[2]Tsigouri,A.D.,U.Menkissoglu-Spiroudi,and A.Thrasyvoulou,Study of tau-fluvalinate persistence in honey.Pest Management Science,2001.57（5）:467-471.

[3]Corta,E.Bakkali,A.Barranco,A.et al.,Study of the degradation products of bromopropylate,chlordime form,coumaphos,cymiazole,flumethrin and tau-fluvalinate in aqueous media.Talanta,2000.52（2）:169-180.

[4]Fries,I.,K.Wallner,and P.Rosenkranz,Effects on Varroa jacobsoni from acaricides in beeswax.Journal of Apicultural Research,1998.37（2）:85-90.

[5]Lodesani,M.Costa,C.Serra,G.et al.,Acaricide residues in beeswax after conversion to organic beekeeping methods.Apidologie,2008.39（3）:324-333.

[6]Skerl,M.I.S.,V.Kmecl,and A.Gregorc,Exposure to Pesticides at Sublethal Level and Their Distribution Within a Honey Bee（Apis mellifera）Colony.Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2010.85（2）:125-128.

[7]Http://pesticideinfo.org/Detail_Chemical.jsp Rec_Id=PC38853

[8]Food and Drug Administration of the United States.Pesticides tolerances.http://www.cfsan.fda.gov