劉俊渤，王艷玲，唐珊珊，常海波，梁大棟

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春130118)

近年來，分子印跡聚合物(MIPs)因其具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性［1］，較高的親合性和靈敏度［2－3］，可從復(fù)雜基質(zhì)中快速分離、純化及富集待測(cè)物而被作為選擇性固相萃取吸附劑材料應(yīng)用于食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域［4－6］。實(shí)際合成 MIPs過程中，模板分子與功能單體的結(jié)合過程是MIPs制備的關(guān)鍵步驟，尤其是兩者的比例直接影響MIPs的吸附性及選擇性［7－8］。目前，文獻(xiàn)中恩諾沙星分子印跡聚合物(ENRO－MIPs)制備多采用甲基丙烯酸(MAA)作為功能單體，恩諾沙星(ENRO)與MAA的比例分別為 1∶4［9－10］、1∶6［11］或 1∶8［12－13］，存在較大差異。因此本研究以ENRO為模板分子，MAA為功能單體，采用沉淀聚合法合成ENRO－MIPs，優(yōu)化模板分子與功能單體的比例、溶劑種類及溶劑用量，并通過靜態(tài)吸附法研究MIPs的吸附性與選擇性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 ENRO、CIP和 OFL，純度 ＞98%，上海源葉生物科技有限公司;MAA、偶氮二異丁腈(AIBN)、乙腈(ACN)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、三氯甲烷、甲苯、甲醇、乙酸、磷酸，均為分析純。T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)、HH－S恒溫水浴鍋、THZ－82A型水浴恒溫振蕩器、KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器、FA2104N電子天平、DZF－6020真空干燥箱、JSM－6510掃描電子顯微鏡。

1.2 MIPs和NIPs的制備 稱取一定比例的ENRO和MAA于溶劑中超聲溶解，靜置24 h，再加入一定量的EDMA(功能單體MAA與交聯(lián)劑EDMA的摩爾比為1∶5)和50 mg的AIBN，超聲30 min，充氮脫氧，密封，置于60℃水浴鍋中反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后將聚合產(chǎn)物離心，用乙酸/甲醇(2/8，V/V)溶液索氏提取，直至洗脫的溶液中檢測(cè)不到ENRO為止，再用甲醇洗至中性，處理完畢后50℃真空干燥至恒重，得到MIPs。

NIPs制備過程除不加模板分子ENRO外，其余過程與其MIPs制備條件相同。

1.3 MIPs和NIPs的靜態(tài)吸附性試驗(yàn) 稱取20.0 mg已洗脫、干燥的MIPs，置于50 mL具塞三角瓶中，加入5 mL不同濃度ENRO溶液，放入28℃恒溫振蕩器中振蕩20 h，取上清液用0.22 μm的濾頭過濾，稀釋一定的濃度，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定ENRO的游離濃度，根據(jù)結(jié)合前后ENRO濃度的變化計(jì)算MIPs對(duì)ENRO的結(jié)合量Q。NIPs的結(jié)合量Q的變化測(cè)定方法與MIPs一致。

其中，Q為MIPs(或NIPs)對(duì)ENRO的吸附量(mg/g)，c0、c分別為ENRO的初始濃度和吸附后的濃度(mg/L)，V為吸附溶劑的體積(mL)，W為MIPs(或NIPs)微球的質(zhì)量(mg)。

1.4 MIPs和NIPs的選擇性試驗(yàn) 稱取20 mg洗脫、干燥后的納米聚合物(MIPs或NIPs)，分別加入到5 mL初始濃度為100 mg/L的CIP、OFL與ENRO的溶液中，28℃恒溫水浴振蕩器中振蕩20 h。吸附平衡后用0.22 μm的濾頭過濾，稀釋一定的濃度，在不同吸光度條件下測(cè)定溶液中CIP、OFL與ENRO的游離濃度(OFL在295 nm，CIP在275 nm，ENRO在278 nm)。平行測(cè)定3次，取平均值。

1.5 MIPs循環(huán)利用試驗(yàn) 稱取20.0 mg的MIPs，置于50 mL具塞三角瓶中，加入5 mL不同濃度ENRO－磷酸溶液，放入28℃恒溫振蕩器中振蕩，20 h后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定平衡濃度，并將達(dá)到飽和的MIPs回收，用乙酸/甲醇(2/8，V/V)溶液洗脫，再用甲醇洗至中性，處理完畢后50℃真空干燥至恒重。重復(fù)上述步驟，研究MIPs的使用壽命以及反復(fù)利用的吸附效果。

1.6 MIPs和 NIPs的表征 用甲醇將 MIPs(或NIPs)溶液稀釋到一定濃度，超聲30 min，滴于硅片上，自然烘干后噴金，采用JSM－6510掃描電鏡觀測(cè)MIPs(或NIPs)微球的大小及形貌，并用Nano Measurer 1.2軟件統(tǒng)計(jì)微球粒徑。同時(shí)采用Spectrum 100紅外光譜儀對(duì)制備的MIPs(或NIPs)進(jìn)行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIPs的制備

2.1.1 模板分子與功能單體比例的優(yōu)化 固定其他條件，改變模板分子與功能單體的比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 和1∶8，測(cè)定不同比例MIPs的吸附量，見圖1。圖1可以明顯看出模板與功能單體比例為1∶4的MIPs吸附量最大。這說明分子印跡過程中模板分子與功能單體比例的選擇非常重要，它不僅影響印跡分子的鍵合速度與釋出，而且還制約著MIPs的吸附性。ENRO與MAA最佳結(jié)合比例為1∶4的MIPs結(jié)構(gòu)見圖2。

圖1 ENRO與MAA不同比例MIPs的吸附量

圖2 ENRO與MAA1∶4比例的MIPs結(jié)構(gòu)

2.1.2 溶劑種類及用量的優(yōu)化 試驗(yàn)討論了甲苯、三氯甲烷、DMF及ACN四種溶劑對(duì)微球形態(tài)與粒徑大小的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示:甲苯對(duì)于ENRO溶解性極差，以三氯甲烷為溶劑得到油狀MIPs，以DMF為溶劑生成的MIPs呈凝膠狀態(tài)，而以ACN為溶劑制備的MIPs體系為分散均勻、穩(wěn)定，體系粘度低的乳液。沉淀聚合制備MIPs過程中，溶劑對(duì)MIPs微球形態(tài)與粒徑大小起關(guān)鍵作用［14－15］。所選用的溶劑必須能溶解功能單體、模板分子、交聯(lián)劑等，但對(duì)MIPs不溶才能使MIPs沉淀成核，而所選用的溶劑對(duì)MIPs的溶解性太好或者太差都會(huì)導(dǎo)致MIPs形成微凝膠或者不規(guī)則微粒。

沉淀聚合的機(jī)理決定了反應(yīng)溶劑的體積對(duì)MIPs的形成起到關(guān)鍵作用［16］，溶劑量少會(huì)導(dǎo)致MIPs結(jié)塊，即本體聚合;溶劑量太大，會(huì)導(dǎo)致聚合度過低不能形成微球沉淀或者微球形態(tài)不均。試驗(yàn)改變ACN的用量(15、30、45 mL)制備 ENROMIPs，其掃描電鏡見圖3。當(dāng) ACN用量為15 mL，MIPs(圖3A)分散性不好，粘連度高，幾乎成塊狀，微粒不規(guī)則且粒徑大，其吸附量為4.02 mg/g;當(dāng)ACN用量為30 mL，MIPs(圖3B)分散性好，大小均一，近似球形，且粒徑小，吸附量增加，為6.28 mg/g;當(dāng)ACN用量為45 mL，MIPs(圖3C)微球大小不均，粒徑范圍較寬(130～270 nm)，合成率低，其吸附量為4.78 mg/g。所以，在試驗(yàn)的條件下，優(yōu)化ACN的最佳用量為30 mL。

圖3 MIPs在不同溶劑ACN用量條件下的掃描電鏡圖

2.2 MIPs和NIPs的電鏡表征 利用掃描電子顯微鏡對(duì)制備得到的MIPs(圖4A)和NIPs(圖4B)進(jìn)行表征。通過Nano Measurer1.2軟件統(tǒng)計(jì)，MIPs的粒徑范圍是190～290 nm，而NIPs的粒徑在120～230 nm。這說明模板分子ENRO占有一定的空間，洗脫之后留下特異性識(shí)別的孔穴。

圖4 MIPs和NIPs的掃描電鏡照片

2.3 紅外分析 紅外光譜可反映MIPs的結(jié)構(gòu)信息，MIPs和NIPs紅外光譜見圖5。從圖中可以看出，MIPs和NIPs紅外光譜相近，但單體MAA特征基團(tuán)C=O、O－H振動(dòng)峰的位置、寬度和強(qiáng)度有明顯差別。1740 cm－1處是C=O振動(dòng)吸收峰，ENRO模板分子加入形成ENRO－MIPs后，上述譜帶紅移至1729 cm－1處，這是因MAA分子中的C=O與ENRO的質(zhì)子給體C－H或O－H形成氫鍵，使C=O鍵弱化所致(圖2)。圖5還可看到，NIPs在3450 cm－1處有羧酸中O－H的伸縮振動(dòng)吸收峰，而MIPs中OH的吸收峰在3436 cm－1，其吸收峰不僅加寬、增強(qiáng)且譜帶向低頻率方向紅移了14 cm－1，這表明單體MAA分子中的質(zhì)子給體O－H與模板ENRO分子的質(zhì)子受體C=O可形成較強(qiáng)的氫鍵(圖2)。

圖5 MIPs和NIPs的紅外圖譜

2.4 ENRO－MIPs的吸附性能 使用靜態(tài)吸附法測(cè)定MIPs和NIPs對(duì)不同濃度的ENRO的吸附等溫線，見圖6。從圖6可以看出，在ENRO的初始濃度為800 mg/L時(shí)，無論是MIPs還是NIPs都達(dá)到最大飽和吸附量。MIPs最大飽和吸附量為25.07 mg/g，NIPs最大飽和吸附量為13.05 mg/g。隨著ENRO濃度的增加，MIPs和NIPs對(duì)ENRO的吸附量逐漸增加，且在相同初始濃度下單位質(zhì)量MIPs的吸附量遠(yuǎn)大于單位質(zhì)量NIPs的吸附量，這表明MIPs對(duì)ENRO具有較好的印跡效果。兩者吸附量的差別主要是因?yàn)镸IPs納米微球中存在特異的結(jié)合位點(diǎn)，選擇了在氫鍵作用活性位點(diǎn)、分子大小及空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的印跡分子ENRO，因此吸附主要以特異性吸附為主，而NIPs只能依靠非特異性吸附，吸附能力較弱。

在分子印跡的研究中，通常用Scatchard來分析制備的MIPs的結(jié)合性能，Scatchard方程式為:

其中c為溶液吸附平衡濃度(mg/L)，Q為平衡吸附量(mg/g)，Qmax最大飽和吸附量，Kd為平衡離解常數(shù)。

圖6 MIPs和NIPs對(duì)ENRO的靜態(tài)吸附性

以Q為橫坐標(biāo)，Q/c為縱坐標(biāo)作圖，得到Scatchard分析圖(圖7)。由圖7可以看出，Q/c對(duì)Q呈非線性關(guān)系，表明在所研究的ENRO濃度范圍內(nèi)，MIPs主要存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。其擬合的線性方程分別為Q/c=150.2547－4.3228Q和Q/c=98.3218－1.7119Q，由直線的斜率和截距可以得到高親和性位點(diǎn)的離解常數(shù)為Kd1=0.2313 g/L，最大表觀結(jié)合量Qmax1=34.7540 mg/g;低親和性位點(diǎn)的離解常數(shù)為Kd2=0.5841 g/L，最大表觀結(jié)合量 Qmax2=57.4298 mg/g。與已有文獻(xiàn)［17］相比，該條件下制備的MIPs具有更好的結(jié)合性。

圖7 MIPs對(duì)ENRO的Scatchard分析圖

2.5 選擇吸附性能研究 為了進(jìn)一步研究制備的MIPs和NIPs對(duì)ENRO的選擇吸附性。本試驗(yàn)選擇了與ENRO結(jié)構(gòu)相似的CIP和OFL作為底物，利用等溫平衡吸附的方法測(cè)定MIPs和NIPs對(duì)ENRO、CIP和OFL的吸附量，結(jié)果如圖8。

圖8 MIPs與NIPs對(duì)ENRO、CIP和OFL的選擇吸附性

從圖8可以看出，MIPs對(duì)ENRO的吸附性明顯高于MIPs對(duì)CIP、OFL的吸附性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異吸附行為。而NIPs對(duì)ENRO、CIP、OFL三者的吸附量很接近，表明其吸附是廣泛的，沒有選擇性。MIPs和NIPs的這種差異表明它們之間的結(jié)構(gòu)顯著不同，原因在于MIPs中存在著與模板分子ENRO空間結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)的結(jié)合位點(diǎn)相互補(bǔ)的孔穴。這些孔穴對(duì)模板分子ENRO表現(xiàn)出特異的吸附能力，而在NIPs合成時(shí)沒加模板分子，也就沒有空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的孔穴，所以只表現(xiàn)出一般的吸附性。

2.6 MIPs的循環(huán)使用性能 采用相同的洗脫處理方法，經(jīng)過反復(fù)的吸附－洗脫試驗(yàn)研究了MIPs循環(huán)使用性能，表1為MIPs的使用次數(shù)、MIPs對(duì)ENRO的吸附量以及MIPs的回收損失率。在使用四次后MIPs的吸附率為92.05%，說明MIPs可以反復(fù)使用。

表1 MIPs的循環(huán)使用性

3 結(jié)論

采用沉淀聚合法合成ENRO－MIPs，優(yōu)化模板分子與功能單體的比例、溶劑種類及溶劑用量。按最佳比例1∶4合成的MIPs對(duì)ENRO模板分子表現(xiàn)較強(qiáng)的特異性吸附能力，且離解平衡常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別為 Kd1=0.2313 g/L、Qmax1=34.7540 mg/g、Kd2=0.5841 g/L、Qmax2=57.4298 mg/g，且具有較好的循環(huán)使用性。本研究為ENRO－MIPs的選擇性分離、富集和檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)食品樣品中的ENRO提供了參考依據(jù)。

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