王鶴佳，劉智宏，汪 霞，黃耀凌，孫 雷

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京，100081)

尼卡巴嗪(Nicarbazine)又名球蟲凈，是一種廣譜抗球蟲藥物，其為 4，4’－二硝基均二苯脲(DNC)和2－羥基－4，6－二甲基嘧啶(HDP)的等分子復合體，其中DNC含量為 67.4% ～73.0%。DNC－HDP復合體的抗球蟲活性約為DNC的10倍。尼卡巴嗪對雞、火雞等禽類球蟲病均有很好的預防和治療效果，但蛋雞使用尼卡巴嗪后，可導致蛋殼色素沉著，孵化率降低［1］。我國農(nóng)業(yè)部公告第235號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定，尼卡巴嗪的標志殘留物為DNC，在雞肌肉、肝臟、腎臟、皮/脂肪中的最高殘留限量均為 200 μg/kg，，同時還明確規(guī)定蛋雞產(chǎn)蛋期禁用［2］。

尼卡巴嗪在畜禽產(chǎn)品中的測定方法主要有酶聯(lián)免疫檢測法［3－5］、高效液相色譜法、高效液相色譜－質(zhì)譜法［6］和高效液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜法［7］。國內(nèi)尚無商品化的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。試驗通過人工抗原制備、動物免疫，獲得抗DNC的抗體，并在基礎(chǔ)上建立了雞肉中尼卡巴嗪殘留酶聯(lián)免疫檢測方法，其在靈敏度、準確度和精密度等方面能夠滿足雞肉中尼卡巴嗪殘留檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑、碳二亞胺(Carbodiimide)，N－琥珀酰－L－丙氨酰－L－丙氨酰－L－丙氨酸－4－硝基苯胺(N－succinyl－L－alanyl－L－ananyl－L－alanine－4－Nitroanilide，SAN)，均購自 sigma公司;酶標羊抗兔抗體為本實驗室自制;DNC標準品，德國WITEGA公司;其他化學試劑均為分析純。

1.1.2 溶液 洗滌緩沖液:0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，0.05%Tween －20，pH7.2。封閉液:5% 脫脂奶磷酸鹽緩沖液。包被緩沖液:0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.5)。標準溶液:0、0.2、1、5、25、125 μg/L DNC標準品溶液。底物溶液:0.01%TMB，以0.1 mol/L磷酸鹽－檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制。樣品稀釋液:20%甲醇水溶液。

1.1.3 儀器 酶標讀數(shù)儀，型號SUNRISE，TECAN公司;臺式高速冷凍離心機，型號Biofuge stratos，Heraeus公司;漩渦振蕩器，型號MS2，IKA公司;電子天平，型號AE240，梅特勒公司。

1.1.4 動物 新西蘭大耳白兔，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 DNC人工抗原的合成 用碳二亞胺法分別將SAN與牛血清白蛋白和兔血清白蛋白偶聯(lián)作為免疫抗原及檢測抗原［8］，于－20℃保存。采用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測定免疫抗原分子量，由公式(Ma－Mp)/Mt計算蛋白與藥物結(jié)合比，其中Ma為合成抗原分子量，Mp為載體分子量，Mt為DNC分子量。

1.2.2 DNC抗體的制備和鑒定 以免疫抗原免疫白兔，首次免疫用2 mg/mL免疫抗原(以載體蛋白計)1 mL，加等量弗氏完全佐劑乳化，背部皮內(nèi)多點注射。每隔2～3周加強免疫一次，用1 mg/mL免疫抗原加等量弗氏不完全佐劑，肌肉注射。最后一次免疫后10 d采血，用競爭ELISA法測定抗體效價和對100 μg/L尼卡巴嗪的抑制率?？贵w效價和抑制率達到要求后，兔頸動脈放血，提取血清，于－20℃保存。

1.2.3 競爭ELISA的建立 將檢測抗原用包被緩沖液稀釋，包被酶聯(lián)板，每孔150 μL，2～8℃放置過夜。傾去孔內(nèi)液體，拍干，每孔加入封閉液250 μL，室溫放置2 h，傾去孔內(nèi)液體，拍干備用。每孔加入50 μL標準(或樣品)溶液和50 μL抗體溶液，室溫孵育1 h。傾去孔內(nèi)液體，拍干，洗液洗板3次，每孔加入酶標抗體溶液100 μL，室溫孵育30 min。傾去孔內(nèi)液體，拍干，洗液洗板3次。加入底物溶液100 μL，避光顯色20 min。每孔加入終止液100 μL，在450 nm波長處測定吸光度值。

1.2.4 標準曲線 選擇從0到1000 μg/L系列濃度的標準溶液，按.1.2.3方法測定。采用R－biopharm軟件，以抑制率為縱坐標，以DNC濃度為橫坐標，繪制樣條標準曲線，確定標準曲線工作范圍。

1.2.5 50%抑制濃度(IC50) 確定合適的標準曲線工作濃度范圍后，重復測定標準曲線15次，確IC50范圍。

1.2.6 交叉反應率 選擇尼卡巴嗪同類藥物、類似物或可能聯(lián)合使用藥物，按1.2.3方法測定IC50，計算交叉反應率。交叉反應率=DNC IC50/待測藥物IC50×100%。

1.2.7 樣品前處理方法 雞肉勻質(zhì)后，稱取2±0.02 g，置于50 mL 離心管內(nèi)，加乙腈8.0 mL，渦旋，超聲10 min，5000 r/min 離心 10 min。取上清液 4.0 mL于40～50℃下氮氣吹干，加正己烷1.0 mL，加75%甲醇水溶液1.0 mL，充分渦旋混合，2000 r/min離心10 min，取下層溶液，用樣品稀釋液5倍稀釋后供酶聯(lián)免疫法測定。

1.2.8 檢測限 取經(jīng)確認不含待測藥物的20個不同來源的雞肉樣品作為空白雞肉樣品，計算測定值的平均值和標準差，雞肉中DNC檢測限為平均值加3倍標準差。

1.2.9 準確度與精密度 取空白雞肉樣品，加入DNC標準溶液，使其添加濃度分別為50、100和200 μg/kg。每個濃度制備樣品6份，測定樣品濃度，重復3次。計算回收率和相對標準偏差。

2 結(jié)果

2.1 抗原和抗體的制備與鑒定 本試驗合成的SAN－人血清白蛋白經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測定，分子量約為70 kD，SAN與蛋白結(jié)合比約為12∶1。根據(jù)報道，免疫抗原中半抗原與載體蛋白的結(jié)合比一般以5∶1～25∶1為宜，因此本抗原適宜作為免疫抗原。抗體效價為1∶2000倍。

2.2 檢測方法的確定 用方陣滴定法對ELISA方法條件進行優(yōu)化，檢測抗原以4000倍稀釋、抗DNC抗體以2000倍稀釋、酶結(jié)合物以2000倍稀釋、抗體與藥物反應時間為1 h、酶結(jié)合物反應時間為30 min、底物反應時間為10～30 min、、抗體與藥物體積比為50 μL∶50 μL、反應溫度在 25℃時，最大吸光度值在1.5左右。

2.3 標準曲線 標準曲線濃度點確定為0、0.2、1.0、5.0、25.0、125 μg/L。標準曲線見圖1。圖中抑制率為縱坐標，DNC 濃度為橫坐標，IC50為10.3μg/L。

2.4 50%抑制濃度(IC50) 統(tǒng)計15次IC50測定結(jié)果，其變動范圍為10.0 ～19.3 μg/L(表1)。

表1 標準曲線50%抑制濃度(IC50)測定結(jié)果(μg·L－1)

2.5 檢測限 雞肉中DNC測定平均值為1.34 μg/kg，標準差為 2.62 μg/kg，檢測限為 9.20 μg/kg。

2.6 特異性 測定DNC、尼卡巴嗪原料藥、地克珠利、鹽霉素等8種藥物的IC50，計算交叉反應率，結(jié)果見表2。

表2 DNC抗體與尼卡巴嗪原料藥等8種藥物的交叉反應率

特異性試驗結(jié)果表明，抗體對DNC和尼卡巴嗪原料藥均有反應，與尼卡巴嗪原料藥的交叉反應率為50%，這與原料藥中約含有50%的DNC相一致。2.7 準確度與精密度 DNC以50、100和200 μg/kg三個濃度水平添加至空白雞肉樣品中，回收率范圍在49.4% ～118%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于20%。

表3 雞肉中DNC準確度和精密度結(jié)果

3 討論

3.1 半抗原的選擇 農(nóng)業(yè)部公告第235號規(guī)定尼卡巴嗪的殘留標志物為DNC，但DNC分子中不具有與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團，故選擇與DNC結(jié)構(gòu)類似且具有活性基團的谷氨酸－γ－ρ－硝基苯胺［glutamic acid gamma－(ρ－nitroanilide)，GAN］和SAN兩種化合物作為半抗原，分別對其結(jié)構(gòu)進行改造后，再與大分子蛋白偶聯(lián)。免疫動物后獲得兩種抗體，結(jié)果表明由SAN免疫獲得的抗體效價遠高于GAN，故選擇SAN抗體進行后續(xù)試驗。

3.2 溶劑的選擇 DNC標準品溶解性差，不溶于甲醇、乙腈等溶劑，僅能溶解于N，N－二甲基甲酰胺(DMF)和二甲亞砜(DMSO)中，由于DMSO具有刺激性氣味，故選擇DMF做為溶劑。此外，通過對多種試劑的摸索，最終選擇20%甲醇水溶液作為樣品稀釋液，既能滿足樣品溶解性的要求，又可將有機溶劑對酶聯(lián)免疫反應的影響降至最低。

［1］ 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2011:179－180.

［2］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告235號.動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.

［3］ Huet A，Mortier L，Daeseleire E，et al.Screening for the coccidiostats halofuginone and nicarbazine in egg and chicken muscle:development of an ELISA［J］.Food Additives and Contaminants，2005，22(2):128－134.

［4］ Lisa C，Terence L F，Steven R H，et al.The production and characterisation of dinitrocarbanilide antibodies raised using antigen mimics［J］.Journal of Immunological Methods，2002(264):45－51.

［5］ Hagren V，Crooks S，Elliott R H，et al.An all－on－ line dry chemistry immunoassay for the screening of coccidiostat nicarbazin in poultry eggs and liver［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(9):2429 －2433.

［6］ 章 虎，吳俐勤，楊彩梅，等.尼卡巴嗪殘留量測定和安全性分析［J］.現(xiàn)代科學儀器，2005，1:58－60.

［7］ 孫 雷，張 驪，劉智宏，等.雞蛋和雞肉中尼卡巴嗪殘留檢測高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法研究［J］.中國獸藥雜志，2008，42(5):1－4.

［8］ 楊利國，胡少昶，魏平華，等.酶免疫測定技術(shù)［M］.南京:南京大學出版社，1998:395－400.