贠志敏，張雪，李素波，檀英霞，冷泠，季守平，高紅偉，宮鋒

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所血液分子生物學(xué)研究室，北京 100850

人體移植器官嚴(yán)重短缺日益受到關(guān)注，而異種移植是解決人體移植器官短缺的有效方法之一，也是現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要熱點(diǎn)問題。豬的器官在結(jié)構(gòu)、大小和生理功能上與人體相近，并且豬易于繁殖，成熟周期短，一胎多子，所患疾病易于控制，在倫理學(xué)方面相對(duì)于靈長(zhǎng)類動(dòng)物更易接受，因此豬被認(rèn)為是異種移植最理想的供體之一。

研究表明，α-Gal 抗原是異種移植的主要異種抗原之一，它表達(dá)于除人和舊大陸猴外的所有哺乳動(dòng)物體內(nèi)，只是在種類和個(gè)體間表達(dá)量上有差異[1]。人體內(nèi)存在天然的抗α-Gal 抗體，將動(dòng)物的細(xì)胞、組織和器官移植給人體，將出現(xiàn)超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）。這些天然抗體在數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)之后與移植物抗原結(jié)合，導(dǎo)致血管內(nèi)皮被補(bǔ)體成分溶解/破壞，使血管完整性被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致水腫和出血進(jìn)入下層組織。此外，凝血通路被激活，導(dǎo)致纖維蛋白單體沉淀，微血栓形成，最終致移植物腫脹、色澤暗紅、流血量少、變軟、無彈性、器官功能衰竭。因此，異種移植首先須清除異種抗原。國(guó)外的相關(guān)研究表明，使用α-半乳糖苷酶能有效清除異種細(xì)胞、組織表面抗原末端的α-Gal 殘基，降低HAR強(qiáng)度，延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間[2-4]。

本實(shí)驗(yàn)室從原核生物脆弱類桿菌（Bacteroides fragilis）中克隆并表達(dá)了一種新型α-半乳糖苷酶[5]，屬CAZy GH110 家族。研究表明，該酶不僅可切除支鏈多糖末端的α-Gal（Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-R），也可切除直鏈多糖末端的α-Gal（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R）[5-6]。豬體細(xì)胞表面的α-Gal抗原是以α-Gal為末端的直鏈多糖結(jié)構(gòu)[7]。我們檢測(cè)率豬體細(xì)胞表面的α-Gal 抗原，并進(jìn)行了新型α-半乳糖苷酶去除α-Gal抗原的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

豬胚腎細(xì)胞系PK-15 和豬睪丸細(xì)胞系ST（培養(yǎng)條件均為高糖DMEM+5%胎牛血清）由野戰(zhàn)輸血研究所章金剛教授惠贈(zèng)；豬成纖維細(xì)胞系11WP1（培養(yǎng)條件為高糖DMEM+15%胎牛血清）和五指山小型豬紅細(xì)胞（pRBC）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所潘登科教授提供。FITC-IB4 凝集素為Sigma 公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為Cytomics FC 500 Beckman Coulter。

1.2 豬紅細(xì)胞的酶解實(shí)驗(yàn)[6]

采集的五指山小型豬抗凝血于500 r/min 離心5 min，棄上層血漿，用酶解緩沖液（250 mmol/L 甘氨酸，3 mmol/L NaCl，pH6.8）分別按1∶1、1∶4 洗滌紅細(xì)胞2 次；按紅細(xì)胞壓積為40%加入不同劑量的重組α-半乳糖苷酶，于26℃酶解反應(yīng)箱內(nèi)緩慢振蕩孵育2 h，酶解清除紅細(xì)胞α-Gal抗原；用PBS 按1∶4洗滌紅細(xì)胞2 次，加入1/2 體積的MAP 液保存紅細(xì)胞；取部分酶解前后的紅細(xì)胞，分別用4%多聚甲醛固定備用。

1.3 豬體細(xì)胞的酶解實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS 洗2 次，胰酶消化5 min，血清終止后500 r/min離心3 min，棄上清，將收集的細(xì)胞用酶解緩沖液（250 mmol/L 甘氨酸，3 mmol/L NaCl，pH6.8）洗滌2 次，分別加入不同劑量（表1）的重組α-半乳糖苷酶，酶解體系為300 μL，細(xì)胞數(shù)為1×106，于26℃酶解反應(yīng)箱內(nèi)緩慢振蕩孵育2 h 后離心棄上清，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，用4%多聚甲醛固定備用。

1.4 FCAS 分析酶處理前后細(xì)胞表面α-Gal 抗原的含量

IB4是從植物中提取的一種凝集素，可特異地與以α-Gal 為末端的糖鏈結(jié)合，而異種抗原（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R 和Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-R）是以α-Gal 為末端的糖鏈結(jié)構(gòu)。用FITC-IB4 凝集素（25 μg/mL）標(biāo)記固定的細(xì)胞，室溫反應(yīng)3 h，用PBS 洗滌2 次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，按下式計(jì)算α-Gal清除率：

2 結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，pRBC、PK-15、ST、11WP1 細(xì)胞均表達(dá)α-Gal 抗原，但表達(dá)量明顯不同，11WP1 的表達(dá)量最高，平均熒光強(qiáng)度為598，而pRBC 的最低，平均熒光強(qiáng)度只有33，因此各種細(xì)胞所需酶量不同（圖1，表1）。用0.04 mg/mL 的α-半乳糖苷酶酶解2 h 后，pRBC 表面的α-Gal 抗原清除率可達(dá)99.84%；用0.5 mg/mL 的α-半乳糖苷酶酶解2 h 后，PK-15、ST、11WP1 細(xì)胞表面的α-Gal 抗原清除率可達(dá)90%以上，但仍沒有被完全清除，可能是因?yàn)檫@幾類細(xì)胞表面的α-Gal 抗原表達(dá)量較高，需要酶解更長(zhǎng)的時(shí)間。

表1 α-半乳糖苷酶酶解細(xì)胞表面α-Gal抗原所需劑量

3 討論

α-Gal 抗原是異種移植的主要異種抗原之一，表達(dá)于除人和舊大陸猴外的所有哺乳動(dòng)物體內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)，脆弱桿菌來源的α-半乳糖苷酶酶解清除動(dòng)物紅細(xì)胞表面異種抗原α-Gal 的活性遠(yuǎn)高于咖啡豆來源的α-半乳糖苷酶。以酶解豬紅細(xì)胞為例，咖啡豆α-半乳糖苷酶的使用劑量為2～3 mg/mL[8]，而脆弱桿菌來源的α-半乳糖苷酶的使用劑量?jī)H為0.002 mg/mL，并且酶解環(huán)境也從偏酸性變?yōu)橹行?。因此，該新型?半乳糖苷酶是在異種移植中清除α-Gal 抗原，降低移植引起的HAR的理想工具酶。

雖然酶解法能夠去除主要異種抗原，但移植后存活的異種組織或異種器官仍能繼續(xù)分泌α-Gal 抗原，因此這種方法更適于終末期細(xì)胞或代謝率較低的組織或器官，如紅細(xì)胞、皮膚、關(guān)節(jié)、韌帶等，已有這些組織異種移植的相關(guān)報(bào)道和專利[9-11]。本研究證實(shí)，我們獲得的來源于脆弱桿菌的α-半乳糖苷酶可用于清除不同類型豬體細(xì)胞表面的α-Gal 抗原，提示該酶可用于克服異種移植的HAR，是研制異種皮膚、關(guān)節(jié)、韌帶的關(guān)鍵物質(zhì)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)α-半乳糖苷酶處理前后的細(xì)胞

[1]Galili U,Shohet S B,Kobrin E,et al.Man,apes,and old World monkeys differ from other mammals in the expression of α-galactosyl epitopes on nucleated cells[J].J Biol Chem,1988,263(33):17755-17762.

[2]Eckermann J M,Buhler L H,Zhu A,et al.Initial investigation of the potential of modified porcine erythrocytes for transfusion in primates[J].Xenotransplantation,2004,11(1):18-26.

[3]La Vecchio J A,Dunne A D,Edge A S.Enzymatic removal of alphα-galactosyl epitopes from poricine endothelial cells diminishes the cytotoxic effect of natural antibodies[J].Transplantation,1995,60(8):841-847.

[4]Luo Y,Wen J,Luo C,et al.Pig xenogeneic antigen modification with green coffee bean α-galactosidase[J].Xenotransplantation,1999,6(4):238-248.

[5]高紅偉,李素波,鮑國(guó)強(qiáng),等.一種來源于脆弱類桿菌的α-半乳糖苷酶的理化性質(zhì)及其酶解B 型紅細(xì)胞的工藝研究[J].中國(guó)科學(xué):生命科學(xué),2011,41(10):1030-1036.

[6]高紅偉,張雪,李素波,等.新型α-半乳糖苷酶清除動(dòng)物紅細(xì)胞表面α-Gal抗原的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2012,20(5):1231-1234.

[7]Liu Q P,Yuan H,Bennett E P,et al.Identification of a GH110 subfamily of α-1,3-galactosidases--novel enzymes for removal of the α3Gal xenotransplantation antigen[J].J Biol Chem,2008,283(13):8545-8554.

[8]Tan Yingxia,Gong Feng,Li Subo,et al.Brief report:a new profile of terminal N-acetyllactosamines glycans on pig red blood cells and different expression of α-galactose on Sika deer red blood cells and nucleated cells[J].Glycoconjugate J,2010,27(4):427-433.

[9]Doucet J,Gao Z H,McLaren L A,et al.Modification of xenoantigens on porcine erythrocytes for xenotransfusion[J].Surgery,2004,135:178-186.

[10]Stone K R,Valley M.Bone xenografts[P].US 6,972,041 B1.

[11]Liu Q P,Clausen H.Method of preparing non-human tissues for xenotransplantation using α-Galactosidases[P].US 7,951,552 B2.