張楊，張威，曹文君,2，李運(yùn)明,3，陳長生

1.第四軍醫(yī)大學(xué) 軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，陜西 西安 710032;2.長治醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)部，山西 長治 046000；3.成都軍區(qū)總醫(yī)院 神經(jīng)外科，四川 成都 610083

隨著生物技術(shù)和統(tǒng)計(jì)方法的發(fā)展和改進(jìn)，微陣列技術(shù)可以在一次試驗(yàn)中對整個(gè)基因組進(jìn)行分析，已廣泛應(yīng)用于分析大規(guī)模的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。目前有4 類生物芯片平臺(tái)被廣泛應(yīng)用，即Affymetrix GeneChip 芯片、寡核苷酸探針芯片、cDNA 芯片和商業(yè)化探針芯片。在腫瘤研究領(lǐng)域，微陣列技術(shù)對腫瘤的診斷和分型、治療和預(yù)后，以及探討腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制和發(fā)展都有非常重要的作用。基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析，對腫瘤患者的個(gè)性化治療和腫瘤的分子分型發(fā)揮著越來越重要的作用。

由于微陣列技術(shù)所得到的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)具有高維（成千上萬個(gè)基因）和樣本量小的特點(diǎn)，如何挖掘和解釋其中所蘊(yùn)含的海量基因信息，深層次研究基因功能，選擇適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法對于芯片數(shù)據(jù)的處理至關(guān)重要。微陣列基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)信息的提取及其統(tǒng)計(jì)分析方法的研究，已成為生物與醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)領(lǐng)域中富有挑戰(zhàn)性的重要課題。

1 腫瘤研究中微陣列技術(shù)的流程

微陣列試驗(yàn)的基本過程如圖1 所示?；虮磉_(dá)譜通過計(jì)算機(jī)軟件掃描圖像提取得到的原始數(shù)據(jù)首先通過標(biāo)準(zhǔn)化方法過濾掉那些低質(zhì)量的探針數(shù)據(jù)，即在所有樣本中都表現(xiàn)出較低的信號(hào)強(qiáng)度或變化幅度，對感興趣的表型或條件不可能有貢獻(xiàn)[1]。芯片數(shù)據(jù)只有通過標(biāo)準(zhǔn)化處理后，才能進(jìn)行下游的統(tǒng)計(jì)分析，如篩選差異表達(dá)的基因或腫瘤分型。微陣列技術(shù)通常被作為篩選工具，生物驗(yàn)證和解釋應(yīng)對選定的基因做進(jìn)一步研究。

圖1 微陣列試驗(yàn)流程圖，其中標(biāo)星號(hào)的流程為統(tǒng)計(jì)分析部分

2 cRNA微陣列數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化和預(yù)處理

微陣列數(shù)據(jù)的質(zhì)量對下游的統(tǒng)計(jì)分析至關(guān)重要，包括RNA 的質(zhì)量、探針標(biāo)記、雜交條件、洗板，以及在掃描當(dāng)中的信號(hào)強(qiáng)度和背景干擾。尤其在低豐度表達(dá)RNA 分子的研究中容易受背景系統(tǒng)的影響而導(dǎo)致系統(tǒng)偏差。這些偏移可導(dǎo)致基因表達(dá)數(shù)據(jù)研究的錯(cuò)誤結(jié)論，即假陽性和假陰性的預(yù)測。但這些變異和微陣列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)性偏差可通過科學(xué)的重復(fù)和歸一化進(jìn)行控制。

在實(shí)驗(yàn)過程中，當(dāng)我們從實(shí)驗(yàn)組和對照組樣本中獲得基因表達(dá)譜后，可以通過計(jì)算每個(gè)基因在Cy3和Cy5 通道的熒光染料強(qiáng)度的平均對數(shù)比值而得到該基因的表達(dá)強(qiáng)度[1]。通過比較在不同處理組中該基因表達(dá)強(qiáng)度的差異，對其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。在得到該表達(dá)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)后，首先要進(jìn)行的是將低重復(fù)性的探針數(shù)據(jù)過濾去除。該過程可以通過控制編譯系數(shù)（小于特定的閾值）和表達(dá)密度（大于特定表達(dá)水平）進(jìn)行。經(jīng)過預(yù)處理后，掃描圖像的整體亮度和試驗(yàn)變化所造成的系統(tǒng)性偏差可以得到有效控制。例如，模塊和染料的影響。此步驟對微陣列數(shù)據(jù)的多重比較和下游的統(tǒng)計(jì)分析是必不可少的。這一過程統(tǒng)稱為歸一化。

歸一化的方法很多，其中應(yīng)用最廣泛的是全局歸一化（global normallization）。該方法的目的是將所有芯片探針均歸一化為具有相同的中位表達(dá)強(qiáng)度，這一方法可以很好地矯正模塊數(shù)據(jù)。然而，大量的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究證明模塊數(shù)據(jù)的影響是存在的。針對這一影響，Dudoit 等經(jīng)過不斷研究，發(fā)展了對每個(gè)模塊強(qiáng)度數(shù)據(jù)歸一化方法，稱為“LOESS歸一化”[1]?；旧飳W(xué)假設(shè)是，在一個(gè)模塊中上調(diào)基因和下調(diào)基因的表達(dá)量是基本一致的。由于這一歸一化方法的假設(shè)條件，因此不適用于定制芯片和經(jīng)處理的特定細(xì)胞系表達(dá)數(shù)據(jù)的研究。在該方法的基礎(chǔ)上，Tseng等[2]使用“不變基因集”作為看家基因的代理，并僅基于該不變基因集的強(qiáng)度來估計(jì)模塊強(qiáng)度。Fan 等[3]在沒有以上方法的生物學(xué)假設(shè)條件下，利用陣列內(nèi)重復(fù)，提出切片內(nèi)半線性模型（semilinear in-slide）歸一化方法。該方法基于芯片內(nèi)約100 次的重復(fù)探針，以避免序列特異性和噪音干擾。其基本依據(jù)是，在同一模塊中重復(fù)探針的基因表達(dá)差異基本反映了除隨機(jī)噪音之外的系統(tǒng)誤差，而這些系統(tǒng)誤差可以通過探針配對加以去除。使用切片內(nèi)半線性模型，通過選取神經(jīng)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子靶向基因，以實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)被加以驗(yàn)證，而普通的歸一化方法則容易造成一些基因的缺失。隨后，F(xiàn)an 等[4]通過芯片內(nèi)重復(fù)探針和聯(lián)合其他芯片的信息，顯著擴(kuò)大了這一方法的適用范圍。除了以上歸一化方法外，其他有用的歸一化方法還包括雙向半線性模型[5]和穩(wěn)?。╮obust）歸一化等[6]。

3 芯片內(nèi)重復(fù)

芯片內(nèi)重復(fù)不僅對歸一化的作用很大，而且對于驗(yàn)證數(shù)據(jù)歸一化是否正確也非常有用。其基本的思想是，芯片內(nèi)重復(fù)之間的差異是系統(tǒng)偏差除去后的純粹的隨機(jī)噪聲。當(dāng)估計(jì)每個(gè)單獨(dú)基因的噪聲水平并且芯片通過歸一化，那么總的標(biāo)準(zhǔn)化方差大概服從卡方分布。這對檢測數(shù)據(jù)是否已歸一化提供了一個(gè)簡單而有用的診斷測試方法。這一檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量也可作為一個(gè)給定陣列選擇歸一化方法的標(biāo)準(zhǔn)——最小的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量（最一致的重復(fù)）是最優(yōu)的選擇?？梢酝ㄟ^過濾方法和經(jīng)驗(yàn)貝葉斯的方法估計(jì)相應(yīng)的方差的差異[7]。芯片內(nèi)重復(fù)也被用于改進(jìn)基因集方差估計(jì)的精度，從而提高推斷方法的設(shè)計(jì)來識(shí)別差異表達(dá)基因[8]。

4 篩選差異表達(dá)基因

微陣列實(shí)驗(yàn)的主要目的就是篩選實(shí)驗(yàn)組和對照組或者更復(fù)雜的比較組間的差異表達(dá)基因[9]。選擇恰當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法在此過程中至關(guān)重要。首先，是選擇恰當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，通常是經(jīng)過修正的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，如在微陣列顯著性分析中，修正過的單樣本和兩樣本t檢驗(yàn)、方差分析或經(jīng)典貝葉斯方法[10]。由于微陣列數(shù)據(jù)的一個(gè)顯著特點(diǎn)是一般只有一小部分的基因是差異表達(dá)的，因此，根據(jù)不同芯片本身的特點(diǎn)選擇合適的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，以提高芯片數(shù)據(jù)處理的靈敏度和特異度。

在選擇好檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量之后，下一個(gè)步驟是計(jì)算檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量并由此得出顯著性P值。芯片數(shù)據(jù)常常要同時(shí)處理成千上萬個(gè)基因，相應(yīng)的P值的計(jì)算也較為復(fù)雜。例如，當(dāng)樣本量較大，且服從正態(tài)分布時(shí)，可采用student't 分布以計(jì)算P值；而在小樣本非正態(tài)分布時(shí)，permutation 或bootsrapping 方法是較為合適的選擇。

判斷出P值之后，接下來將是篩選差異表達(dá)的基因。由于微陣列試驗(yàn)同時(shí)檢驗(yàn)成千上萬個(gè)基因，很可能出現(xiàn)較高的陽性結(jié)果錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。因此，控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率對結(jié)果的生物學(xué)解釋至關(guān)重要[11-12]。目前已發(fā)表了很多關(guān)于控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率方法的論文。Storey等[11]和Dudoit等[12]對關(guān)于基因集中控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率的方法進(jìn)行了綜述。這些方法要求非常精確地P值，通常在10-6數(shù)量級。此外，有些方法可以通過判斷檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量是否超過某一界值或相應(yīng)的P值（小于閥值）來篩選差異表達(dá)基因，從而控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率[2,10]。例如，假設(shè)在15 000 個(gè)基因中有100 個(gè)基因相應(yīng)的P值小于0.001，則期望的被錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)的基因數(shù)不超過0.001×15 000=15，那么我們可以估計(jì)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率為15/100=15%[2]。

5 微陣列技術(shù)在腫瘤分類和聚類中的應(yīng)用

微陣列技術(shù)腫瘤臨床研究的一個(gè)重要應(yīng)用是發(fā)現(xiàn)腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物和對腫瘤進(jìn)行病理分類。Inamura 等[13]在其研究中對這一領(lǐng)域進(jìn)行了較為詳細(xì)的闡述。他們在肺癌和正常肺組織標(biāo)本的研究中，通過分層聚類和非負(fù)矩陣因子化的方法將肺鱗狀細(xì)胞癌分為2個(gè)不同的亞型，2個(gè)亞型具有完全不同的分子特征和臨床結(jié)局。

分類也被稱為有監(jiān)督學(xué)習(xí)。許多統(tǒng)計(jì)分析方法被應(yīng)用于聚類和分類，這些方法包括決策樹分類方法、線性鑒別分析、支持矢量機(jī)法，以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)特征分析[14]。使用歸一化芯片數(shù)據(jù)作為輸入向量，可以建立分類規(guī)則。Svrakic 等[15]對基因集中所應(yīng)用的聚類方法做了全面綜述。

通常我們在對腫瘤的分類研究中，希望在篩選基因或腫瘤標(biāo)志物的過程中得到具有較高判別效能和低誤判率的差異表達(dá)基因。這不僅提高了基因在腫瘤中功能的理解，而且降低了錯(cuò)誤分類的幾率?；虮磉_(dá)譜收縮因子方法在腫瘤分類研究中被作為一種重要的分類方法[16]。統(tǒng)計(jì)變量選擇法，如誤判的出發(fā)散度，也可被應(yīng)用于篩選重要的差異表達(dá)基因和腫瘤標(biāo)志物[17]。

聚類也稱為無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，常常用于對基因表達(dá)譜中具有相似表達(dá)特征的基因進(jìn)行歸類[15]。這有利于我們發(fā)現(xiàn)共表達(dá)或表達(dá)特性相似的基因群。聚類算法的一個(gè)重要步驟是如何在輸入空間中定義合適矩陣指標(biāo)，如分層和K最近鄰分類法[15-16]。這些輸入向量既可以是不相關(guān)的基因集中具有相似表達(dá)特性的基因，也可以是不同樣本的同一表達(dá)基因。在聚類過程中，常用的計(jì)算指標(biāo)包括歐氏距離和Pearson 相關(guān)系數(shù)。相似表達(dá)基因通常通過系統(tǒng)樹圖或彩色編碼表示。

6 時(shí)間序列和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為了監(jiān)測基因的隊(duì)列表達(dá)模式，基因隨著疾病的進(jìn)展時(shí)間，或在不同治療中的表達(dá)情況，我們可以在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣獲得基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)上一個(gè)重要的問題是，在某個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)經(jīng)過處理后的基因表達(dá)是否有差異。Hotelling T2檢驗(yàn)可用來驗(yàn)證隨著時(shí)間的推移，基因的表達(dá)譜是否發(fā)生變化。隨著時(shí)間的進(jìn)程，某些基因的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，某些基因的表達(dá)保持不變，可以發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間及條件的變化表現(xiàn)出不同表達(dá)水平的標(biāo)識(shí)基因?；虮磉_(dá)模式的時(shí)間序列也有利于理解與疾病相關(guān)的表達(dá)通路及其功能。單樣本t檢驗(yàn)可用于評估在每個(gè)特定的時(shí)間點(diǎn)基因的表達(dá)是否上調(diào)和下調(diào)或保持不變。那么，基因表達(dá)模式的時(shí)間進(jìn)程可通過一類分類技術(shù)來加以分析，這對理解基因間的調(diào)控過程和生物通路提供了非常有用的工具[15]。Schulte 等[18]研究了不同的基因表達(dá)模式，包括即早基因、“延遲”基因和效應(yīng)基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中TrkA和TrkB 受體中的表達(dá)情況，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)即早基因和下游的靶點(diǎn)調(diào)控中的分子機(jī)理。

目前，在時(shí)間序列微陣列研究中已發(fā)展了許多方法，這些方法都是針對提取時(shí)間過程中的差異表達(dá)基因。Storey等[19]利用基于spline的方法發(fā)現(xiàn)了在時(shí)間過程中基因表達(dá)的改變。Yuan 等[20-21]分別在2006和2008 年用基于隱馬爾科夫算法的模型分析了多種生物條件下的時(shí)間序列微陣列數(shù)據(jù)。Tai和Speed[22]提出了一種多變量經(jīng)驗(yàn)貝葉斯的統(tǒng)計(jì)方法鑒別差異表達(dá)基因。Ma 等[23]在2009 年通過功能性ANOVA 混合效應(yīng)模型將時(shí)間序列基因表達(dá)值分類，并且鑒別差異表達(dá)基因。Zhou 等[24]在2010 年根據(jù)時(shí)間序列基因表達(dá)數(shù)據(jù)發(fā)展了一種對生存結(jié)果的預(yù)測模型。Tibshirani 等[25]在2013 年提出了一種根據(jù)時(shí)間序列基因表達(dá)譜對病人分類的方法，這種方法的提出為腫瘤的個(gè)性化治療提供了新的手段。

基于通路和GSEA 的方法在功能基因組學(xué)研究中已經(jīng)發(fā)展了十余年。由于不完整的信息和通路數(shù)據(jù)注釋不佳，研究人員開始結(jié)合基因集富集分析方法和基于網(wǎng)絡(luò)模塊的方法，以鑒別較大幅度的分子機(jī)制。第三代基因表達(dá)譜分析方法（包括基因集/通路/網(wǎng)絡(luò)分析）可被定義為一個(gè)以知識(shí)為導(dǎo)向的數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的方法，這不僅是基于先驗(yàn)基因集的知識(shí)，而且利用了基因集內(nèi)部或基因集之間的通路/網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。2007 年，Vidal[26]的研究小組在哈佛大學(xué)利用各種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)集對乳腺癌的易感性構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并確定HMMR 為新的疾病易感位點(diǎn)。隨后，TreyIdeker[27]的研究小組在加州大學(xué)圣地亞哥分校綜合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以提高乳腺癌患者轉(zhuǎn)移形成的預(yù)測。這2 項(xiàng)研究是一個(gè)新的里程碑，標(biāo)志著網(wǎng)絡(luò)和通路的激動(dòng)人心的開始，雖然容易出錯(cuò)，而且不完整，但可作為一種導(dǎo)向，引導(dǎo)今后的微陣列數(shù)據(jù)分析。

基因芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于遺傳變異，基因網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控過程中的相互作用，以及生物通路等方面的研究，已成為理解基因的相互作用、協(xié)同、網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等的有力工具[28]。

7 結(jié)語

微陣列技術(shù)正深入到人類腫瘤疾病研究的各個(gè)方面。與其他研究方法相比，該技術(shù)更關(guān)注腫瘤在不同條件下基因表達(dá)的變化?？梢酝ㄟ^微陣列技術(shù)對基因組進(jìn)行分析來確定新的潛在的治療途徑或研發(fā)新的診斷試劑，即所謂的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究[29]。

由于腫瘤受多重因素的影響，因此我們所獲得的差異表達(dá)基因，哪怕是一個(gè)簡單的比較試驗(yàn)，也可能受到其他信號(hào)的干擾。癌癥樣本的來源各異，包括直接手術(shù)活檢的樣本、很有限的針刺活檢樣本、尸檢樣本、特定癌癥所建立的細(xì)胞系，甚至是石蠟固定樣本的切片。當(dāng)比較腫瘤樣本及其正常對照時(shí)，必須確保樣本的匹配度，如乳腺癌樣本必須與相對應(yīng)的正常乳腺細(xì)胞相比較。但這可能很難做到，如活檢樣本不可能是均質(zhì)的，含有多種細(xì)胞類型，是正常和惡性細(xì)胞或不同階段腫瘤細(xì)胞的混合物。此外，腫瘤細(xì)胞的正常對照也可能并不確定，因此需要分析多個(gè)不同的正常樣本。同樣，不同患者樣本的遺傳差異也可能會(huì)影響結(jié)果，需要增加足夠的對照以減少這些因素的干擾。顯然，正常樣本和腫瘤樣本的匹配程度也取決于實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)。如探索性分析實(shí)驗(yàn)的目的是了解某一系統(tǒng)的基本生物學(xué)特征，那么樣本匹配度的要求可能不像生物標(biāo)志物篩選那么嚴(yán)格，因?yàn)樯飿?biāo)志物篩選的目標(biāo)是確定可靠的診斷工具。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、原始數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)方法的選擇，是腫瘤研究中至為重要的步驟。

將一個(gè)基因表達(dá)譜或特殊基因表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)換成生物學(xué)上可以理解的概念，仍然是一個(gè)需要很大努力和充滿挑戰(zhàn)的任務(wù)。在這方面，對人類基因組及其他模式生物基因組功能越來越多的了解，將為基因表達(dá)研究提供大量的補(bǔ)充信息。另外，近年出現(xiàn)的系統(tǒng)生物學(xué)，在轉(zhuǎn)錄組水平的目的是能夠描述支持個(gè)體基因表達(dá)狀態(tài)的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，也將及時(shí)提供細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的可預(yù)見的詳細(xì)圖譜。通過表達(dá)譜分析，可以預(yù)測疾病狀態(tài)的細(xì)胞和組織中受影響的特殊生化途徑和生物學(xué)過程。

腫瘤基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)挖掘不僅對認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)理具有重要意義，而且也會(huì)為腫瘤的分子診斷和防治開辟全新的途徑，并有助于腫瘤個(gè)性化治療的實(shí)現(xiàn)。利用基因表達(dá)譜對腫瘤樣本進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，構(gòu)建腫瘤基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是一項(xiàng)具有重要意義的大課題。

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