婁文靜，張道軍，史云，崔家駿，吳志豪，戚麗華，靳連群，劉雪林，宋宏彬，張傳福

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所，北京 100071

H7N9亞型禽流感是甲型流感病毒中的一種，自暴發(fā)以來，在多個(gè)國家時(shí)有流行和散發(fā)，對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。2013 年我國出現(xiàn)首例人感染H7N9亞型禽流感病毒事件[1-2]；截至目前，共報(bào)道143例確診病例，分布于北京、上海、江蘇、浙江等12 個(gè)省市，其中死亡45人，病死率高達(dá)31.5%[3]。因此，通過對今年暴發(fā)的人源H7N9 亞型禽流感病毒與禽源H7N9亞型病毒的基因同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析，繼而研究監(jiān)測并尋找對抗該病毒的方法是當(dāng)務(wù)之急。

甲型流感病毒基因組是分為8 個(gè)節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，其中第8 段非結(jié)構(gòu)蛋白基因是其基因組中最小的基因節(jié)段，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2[4]。NS1 存在于病毒感染的細(xì)胞中，在正常病毒粒子中不存在，經(jīng)滅活疫苗免疫的動(dòng)物也不會(huì)產(chǎn)生。因此，針對NS1 的抗體可能只在流感病毒的宿主中存在，據(jù)此可以區(qū)分滅活疫苗免疫動(dòng)物和野生型毒株感染動(dòng)物[5]。此外，NS1 還具有抑制宿主蛋白合成、通過與宿主蛋白相互作用來增強(qiáng)病毒的致病性和毒力[6]、拮抗干擾素（IFN）產(chǎn)生及通過抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PKR）-IFN 途徑和PI3K 激活途徑下調(diào)感染細(xì)胞凋亡[7]等功能。上述特點(diǎn)使NS1 在甲型流感病毒的檢測和抗病毒研究中有著廣闊的應(yīng)用前景。

基于以上背景，我們克隆、表達(dá)了人源甲型流感病毒H7N9亞型NS1基因，為進(jìn)一步研究其功能及基于NS1蛋白的抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒株A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）基因組cDNA 由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、克隆載體pMD18-T、限制性內(nèi)切酶、Taq酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T4DNA 連接酶、小量提取質(zhì)粒試劑盒購自TaKaRa 公司；原核表達(dá)載體pET28a 購自Invitrogen 公司；DNA marker 購自Fermentas公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 NS1基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 報(bào)道的A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）株NS1基因序列設(shè)計(jì)PCR 引物，上游引物為5'-CCCATATGGGAGATATACCATGGGCA-3'（劃線部分為引入的NdeⅠ限制性酶切位點(diǎn)），下游引物為5'-GGAATTCCCGGAGCTCGAATTCTTA-3'（劃線部分為引入的EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 目的基因的克隆

從瓊脂糖凝膠中回收PCR 產(chǎn)物，將純化的PCR產(chǎn)物片段與pMD18-T 克隆載體連接成重組質(zhì)粒pMD18-T-NS1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑取白斑進(jìn)行PCR鑒定，對陽性克隆進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站在線比對分析。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將pMD18-T-NS1、pET28a 質(zhì)粒分別用EcoRⅠ/NdeⅠ雙酶切，用T4DNA 連接酶將酶切后的NS1基因與pET28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-NS1，經(jīng)酶切鑒定后，挑選陽性克隆質(zhì)粒送中科西林生物有限公司進(jìn)行基因序列測定，并進(jìn)行序列分析。

1.5 NS1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物檢測

挑取經(jīng)鑒定的陽性單克隆于5 mL LB（Kan+）培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1∶50 的比例轉(zhuǎn)種，擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液D600nm達(dá)0.5～0.7 時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，于37℃誘導(dǎo)表達(dá)2～3 h 后取菌液，12 000 r/min 離心5 min，棄上清，沉淀用PBS反復(fù)洗滌2 次，取1.5 g 菌體沉淀，用15 mL 菌體裂解液重懸，間歇超聲波冰浴破菌后，12 000 r/min離心 5 min，分別收集上清和沉淀，經(jīng)12% SDSPAGE分析重組蛋白的表達(dá)形式，考馬斯亮藍(lán)染色。

1.6 Western印跡鑒定NS1蛋白

將SDS-PAGE 凝膠蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，經(jīng)封閉液封閉后與1∶500 稀釋的His 單克隆抗體反應(yīng)45 min，用含0.05% Tween-20 的PBS（PBST）洗滌3次，再與羊抗鼠IgG-HR 酶結(jié)合物室溫反應(yīng)1 h，PBST充分洗滌后浸入底物顯色液中觀察顏色區(qū)帶。

2 結(jié)果

2.1 NS1基因的序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從GenBank 獲 得2006～2013 年不同 來源的H7N9 型病毒，包括2013 年在我國上海、安徽、江蘇、浙江、福建、廣東、臺灣等地暴發(fā)的H7N9 亞型禽流感病毒的NS1序列，用MEGA 5.0構(gòu)建NJ進(jìn)化樹（圖1）。從拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來看，A/emperor goose/Alaska/44063-061/2006（H7N9）與其余H7N9 型病毒分離株的NS1基因序列分為2 個(gè)進(jìn)化分支。根據(jù)獲得的NS1基因核苷酸序列及推導(dǎo)的編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，A/emperor goose/Alaska/44063-061/2006（H7N9）株與2013 年暴發(fā)的H7N9 型禽流感病毒NS1基因的核苷酸同源性僅為68.5%～70.6%，氨基酸序列同源性為51.1%～96.3%；與2007～2012 年暴發(fā)的H7N9 型禽流感病毒NS1基因的核苷酸同源性為70.5%～71.7%。

進(jìn)化樹表明，2013 年的H7N9 亞型分離株都屬于基因群A 群，而2007～2012 年的分離株屬于基因群B 群。2013 年我國的H7N9 病毒分離株（A 群）其NS1基因存在以A/Wuxi/1/2013（H7N9）為代表和以A/Guangdong/1/2013（H7N9）為代表的2 個(gè)不同的亞分支；而2013 年中國大陸的H7N9 型禽源分離株其NS1基因都屬于A/Wuxi/1/2013（H7N9）為代表的分支，尚未發(fā)現(xiàn)屬于A/Guangdong/1/2013（H7N9）分支的2013 年禽源H7N9 病毒分離株。根據(jù)獲得的NS1基因核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，以A/Wuxi/1/2013（H7N9）為代表的分支的病毒分離株NS1核苷酸同源性為99.2%～100%，氨基酸同源性 為98.5%～100% ；以A/Guangdong/1/2013（H7N9）為代表的分支的病毒分離株NS1基因的核苷酸同源性為95.0%～96.6%，氨基酸同源性為94.3%～98%；同源性比較結(jié)果表明，2013 年的H7N9 型病毒分離株NS1基因高度保守。由B 群分離株的進(jìn)化分支來看，2008 年的危地馬拉分離株、2009 年的江西分離株、2009 年的捷克分離株、2011 年的韓國分離株等屬于不同的進(jìn)化分支，說明H7N9 型禽流感不僅具有時(shí)間相關(guān)性，而且具有地域相關(guān)性。

圖1 H7N9流感病毒NS1基因進(jìn)化樹

2013 年暴發(fā)的H7N9 型禽流感病毒分離株（A群）與2007～2012 年暴發(fā)的H7N9 病毒分離株（B 群）屬于不同的進(jìn)化分支，兩者間NS1基因的核苷酸同源性為86.4%～90.7%，氨基酸序列同源性為72%～87.3%。A 群與B 群在進(jìn)化上的顯著差異暗示甲流病毒變異速度快這一特征，說明今年暴發(fā)的人源H7N9 型禽流感與之前暴發(fā)的禽源H7N9 型禽流感在進(jìn)化上有顯著區(qū)別。因此，對同一種H7N9 型禽流感病毒的不同地域、親緣關(guān)系的研究，有助于進(jìn)一步了解病毒的進(jìn)化特征，為未來基于NS1 蛋白的抗病毒藥物及疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

2.2 NS1基因的擴(kuò)增及克隆質(zhì)粒鑒定

以A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）基因組cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增NS1基因全長，擴(kuò)增片段與預(yù)期大小相符。重組克隆質(zhì)粒pMD18-TNS1 轉(zhuǎn)化菌的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約680 bp 處可見特異性條帶，與預(yù)期相符。測序結(jié)果與A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）株NS1基因序列一致。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

提取重組質(zhì)粒pET28a-NS1，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/NdeⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳得到2 個(gè)片段，其中小片段與目的基因片段大小相符（圖2），測序結(jié)果表明，NS1基因以正確的方式插入pET28a 載體中，且序列正確。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物電泳圖

2.4 NS1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE分析

含pET28a-NS1 重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）經(jīng)0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)后超聲波裂解，SDS-PAGE 分析（圖3）表明有相對分子質(zhì)量為25×103的蛋白表達(dá)，與預(yù)期一致，而未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的對照樣本則沒有預(yù)期蛋白表達(dá)。從圖3可以看出，NS1融合蛋白在菌體裂解后的上清和沉淀中均有，但主要以包涵體形式存在。

2.5 表達(dá)蛋白的特異性鑒定

為了驗(yàn)證相對分子質(zhì)量為25×103的蛋白帶是否由NS1基因表達(dá)，用Western 印跡進(jìn)行了表達(dá)產(chǎn)物的特異性檢測，結(jié)果如圖4，IPTG 誘導(dǎo)樣本有特異條帶，而未加IPTG 誘導(dǎo)的大腸桿菌未見特異條帶，證明該蛋白帶系NS1基因表達(dá)產(chǎn)物。

3 討論

自1988年在美國明尼蘇達(dá)州首次發(fā)現(xiàn)H7N9亞型禽流感以來[8]，陸續(xù)在多個(gè)國家和地區(qū)有該病發(fā)生的報(bào)道，該型病毒在家禽和水禽中廣泛存在，已對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[9]。2013 年我國首次出現(xiàn)H7N9 亞型禽流感感染人的現(xiàn)象，截至目前已造成45人死亡[10]。2013 年10 月，浙江省又出現(xiàn)2例人感染禽流感病例。因此，對該病毒的研究應(yīng)當(dāng)予以重視。目前，相關(guān)研究多側(cè)重于H7N9 病毒血凝素，而對非結(jié)構(gòu)蛋白及其基因的研究較為少見。非結(jié)構(gòu)蛋白只在病毒感染的細(xì)胞中合成，并未包裝進(jìn)病毒顆粒。在病毒感染早期，非結(jié)構(gòu)蛋白就在病毒中大量表達(dá)且積聚在細(xì)胞核內(nèi)，形成致密的晶體樣包涵體，在感染晚期的細(xì)胞漿內(nèi)也有存在，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗NS1 蛋白的抗體[11]。現(xiàn)有研究表明，NS1 蛋白在抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、增強(qiáng)病毒mRNA 翻譯的效率、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制干擾素等方面具有重要作用。因此，拮抗NS1蛋白的功能，對抑制甲型流感病毒的復(fù)制和限制病毒傳播具有良好的應(yīng)用價(jià)值[12]。

圖3 SDS-PAGE檢測pET28a-NS1在大腸桿菌BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡

我們擴(kuò)增了A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）分離株的NS1 基因，并與從GenBank 下載的其他H7N9病毒分離株的NS1基因片段序列和蛋白序列做了對照分析，發(fā)現(xiàn)H7N9 流感病毒的NS1 基因分為A/emperor goose/Alaska/44063-061/2006（H7N9）獨(dú)立分支和基因群A、B 群，其中A、B 群兩群群內(nèi)的核苷酸序列同源性分別為95%～100%和92.1%～100%，而兩群之間的核苷酸同源性僅為86.4%～90.7%。同源性比較表明，2013 年H7N9 禽流感病毒分離株同源性高達(dá)95%以上，在進(jìn)化上高度保守，與之前的H7N9型病毒分離株有明顯的進(jìn)化區(qū)別。

隨著天氣轉(zhuǎn)冷，人感染H7N9 禽流感病例可能會(huì)繼續(xù)出現(xiàn)。此外，目前禽間病毒傳播并未得到控制，且禽類感染H7N9 病毒后很難發(fā)現(xiàn)，難以在早期控制禽類疫情[13]。因此，對H7N9禽流感進(jìn)行監(jiān)測是預(yù)防與控制其暴發(fā)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。我們以此為出發(fā)點(diǎn)，擴(kuò)增了人源H7N9 亞型禽流感病毒的NS1基因，對其進(jìn)行基因克隆，在大腸桿菌BL21（DE3）中高效表達(dá)了NS1 融合蛋白，重組蛋白可以與流感病毒的NS1蛋白單克隆抗體反應(yīng)。這一結(jié)果有助于研究H7N9亞型禽流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的活性、對疫苗免疫和野毒感染的動(dòng)物診斷，并為以NS1 蛋白為基礎(chǔ)的抗病毒藥物的研制奠定了基礎(chǔ)，為將來有效地進(jìn)行禽流感的監(jiān)測工作邁出了關(guān)鍵一步。

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